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1、高效率液相色谱法第一页，本课件共有24页色谱分析法色谱分析法一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法 的特点的特点二、流程及主要部件二、流程及主要部件三、三、影响分离的因素影响分离的因素四、四、高效液相色谱法高效液相色谱法 的主要分离类型的主要分离类型高效液相色谱法高效液相色谱法第二页，本课件共有24页液相色谱仪（液相色谱仪（1）第三页，本课件共有24页液相色谱仪（液相色谱仪（2）第四页，本课件共有24页液相色谱仪（液相色谱仪（3）第五页，本课件共有24页液相色谱仪（液相色谱仪（4）第六页，本课件共有24页一、一、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高
2、速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。第七页，本课件共有24页二、流程及主要部件二、流程及主要部件1.1.流程流程第八页，本课件共有24页2.主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性第九页，本课件共有24页(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入
3、梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第十页，本课件共有24页(3)进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：第十一页，本课件共有24页(4)高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第十二页，本课件共有24页(5)高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器 紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9gmL-1，对流量和
4、温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。第十三页，本课件共有24页光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定定波波长长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第十四页，本课件共有24页三、三、影响分离的因素影响分离的因素 在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。影响分离的主要因素有流动相的流量、性
5、质和极性。第十五页，本课件共有24页1.影响分离的因素影响分离的因素流速流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。第十六页，本课件共有24页2.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。第十七页，本课件共有24页3.流动相及流动相的极性流动相及
6、流动相的极性 （1）可可显显著著改改变变组组分分分分离离状状况况的的流流动动相相选选择择在在液液相相色色谱谱中中显显得特别重要。得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类
7、型型分分离离柱柱上上的的出峰顺序相反。出峰顺序相反。第十八页，本课件共有24页流动相组成流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相相的的极极性性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。或增加选择性，以改
8、进分离或调整出峰时间。第十九页，本课件共有24页选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。
9、（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。时，流动相不应有紫外吸收。第二十页，本课件共有24页四、四、高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型1.1.吸附色谱（液吸附色谱（液-固吸附色谱）固吸附色谱）以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是510m的的硅硅胶胶吸吸附附剂剂。流流动动相相可可以以是是各各种种不不同同极极性性的一元或多元溶剂。的一元或多元溶剂。2.2.分配色谱（液分配色谱（液-液分配色谱）液分配色谱）早早期期通通过过在在担
10、担体体上上涂涂渍渍一一薄薄层层固固定定液液制制备备固固定定相相,现现多多为为化化学学键键合合固固定定相相，即即用用化化学学反反应应的的方方法法通通过过化化学学键键将将固固定定液液结结合合在在担体表面。担体表面。第二十一页，本课件共有24页3.3.离子交换色谱离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.4.凝胶色谱凝胶色谱（空间排阻色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；第二十二页，本课件共有24页请选择内容：请选择内容：第一节第一节 色谱法概述色谱法概述第二节第二节 气相色谱仪气相色谱仪第三节第三节 色谱理论基础色谱理论基础第四节第四节 气相色谱操作条件选择气相色谱操作条件选择第五节第五节 色谱定性、定量方法色谱定性、定量方法第六节第六节 毛细管色谱毛细管色谱第七节第七节 液相色谱法液相色谱法第八节第八节 离子色谱法离子色谱法第九节第九节 高效毛细管电泳高效毛细管电泳第十节第十节 薄层色谱与纸色谱法薄层色谱与纸色谱法结束第二十三页，本课件共有24页第二十四页，本课件共有24页