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1、第二章第二章菌种制备菌种制备微生物的菌种制备微生物的菌种制备微生物的菌种制备微生物的菌种制备在在微微生生物物工工业业应应用用中中，微微生生物物菌菌种种工工作作主主要要包包括以下四方面：括以下四方面：菌菌种种的的分分离离筛筛选选：挑挑选选符符合合生生产产要要求求的的菌菌种种，这这是选种工作的任务。是选种工作的任务。菌菌种种培培育育：改改良良已已有有菌菌种种的的生生产产性性能能，使使产产品品的的质质和和量量不不断断提提高高，或或使使它它更更适适应应于于工工艺艺的的要要求求，这这是是育育种工作的任务。种工作的任务。菌菌种种的的保保藏藏：一一切切生生产产菌菌种种都都要要使使它它避避免免死死亡亡和和生产
2、性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。退退化化菌菌种种的的复复壮壮：如如果果发发现现菌菌种种的的生生产产性性能能下下降降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。一、菌种制备一、菌种制备微生物资源及其丰富，它们栖居了自然界的各个微生物资源及其丰富，它们栖居了自然界的各个角落。按研究和生产的需要进行采集，经过反复角落。按研究和生产的需要进行采集，经过反复分离筛选获得需要的抗生素产生菌，成为原始菌分离筛选获得需要的抗生素产生菌，成为原始菌种。种。原始菌种往往产量较低，发酵时易产生色素和伴原始菌种往往产量较低，发酵
3、时易产生色素和伴生大量不需要或有害的其他代谢产物，需进一步生大量不需要或有害的其他代谢产物，需进一步选育或基因重组获得生产上需要的高产优良菌种，选育或基因重组获得生产上需要的高产优良菌种，生产上习惯称为产生菌种。生产上习惯称为产生菌种。抗生素产生菌的分离和筛选抗生素产生菌的分离和筛选土壤微生物的分离土壤微生物的分离采土：到富集抗生素产生菌的土壤中采土采土：到富集抗生素产生菌的土壤中采土分离：取分离：取510g土样，以无菌水稀释土样，以无菌水稀释100010000倍，吸取倍，吸取0.05ml涂布于培养涂布于培养基上。基上。一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采
4、采采采 样样样样 增增殖殖培培养养增增殖殖培培养养 方法、地点、时间和周围环境记录方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1稀释分离法稀释分离法 2平板划平板划线线分离法分离法 涂菌涂菌：划划线线分离分离：分步划分步划线线法法；一次划一次划线线法：法：3组织组织分离法分离法 测定代谢产物或其它目的性状测定代谢产物或其它目的性状测定代谢产物或其它目的性状测定代谢产物或其它目的性状筛选筛选从大量待筛的微生物中，尽快鉴别少数有从大量待筛的微生物中，尽快鉴别少数有应用价值的抗生素产生菌的实验过程。要应用价值的抗生素产生菌的实验过程。
5、要根据筛选的目的，选择合适的筛选方法。根据筛选的目的，选择合适的筛选方法。方法：琼脂移块法、发酵液扩散法、筛选方法：琼脂移块法、发酵液扩散法、筛选抗肿瘤抗生素法、抗病毒抗生素的筛选、抗肿瘤抗生素法、抗病毒抗生素的筛选、酶抑制剂的特异筛选方法。酶抑制剂的特异筛选方法。纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法 透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法琼脂块培养法琼脂块培养法琼脂块培养法琼脂块培养法 二、菌种选育的经典方法二、菌种选育的经典方法自然选育自然选育诱变育种诱变育种 自然选育概念：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过筛除衰退型菌株，选择维持原有生产水平的菌株的纯种选育的方
6、法。进一步选育或保藏进一步选育或保藏移种生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落斜面种子斜面种子(初筛初筛)高产菌株高产菌株沙土管菌株沙土管菌株斜面种子斜面种子摇瓶复筛摇瓶复筛高产纯化株高产纯化株生产试验生产试验自然选育流程图自然选育流程图筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发酵生产能力的过程。初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。优点：简单易行缺点：效率低、进展慢以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10
7、左右。（一）诱变育种的一般步骤和方法（一）诱变育种的一般步骤和方法出发菌株出发菌株同步培养同步培养 使菌细胞处于相同或接近的生理状态使菌细胞处于相同或接近的生理状态单细单细胞（或胞（或单孢单孢子）菌子）菌悬悬液的制液的制备备 单细胞或单孢子的意义单细胞或单孢子的意义 酵母或霉菌孢子酵母或霉菌孢子10106 6/ml /ml、细菌、细菌10108 8/ml /ml 诱变剂诱变剂的的选择选择及其及其剂剂量的确定量的确定 以致死率为以致死率为9099 为宜为宜诱变处理诱变处理 物理诱变剂物理诱变剂 化学诱变剂化学诱变剂确定出发菌株确定出发菌株确定出发菌株确定出发菌株菌种的纯化选优菌种的纯化选优菌种的
8、纯化选优菌种的纯化选优出发菌株的性能鉴定出发菌株的性能鉴定出发菌株的性能鉴定出发菌株的性能鉴定同步培养同步培养同步培养同步培养制备单细胞（或单孢子）悬液制备单细胞（或单孢子）悬液制备单细胞（或单孢子）悬液制备单细胞（或单孢子）悬液活菌浓度测定活菌浓度测定活菌浓度测定活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变处理诱变处理诱变处理诱变处理平板分离平板分离平板分离平板分离计形态变异的菌落数，计算突变率计形态变异的菌落数，计算突变率计形态变异的菌落数，计算突变率计形态变异的菌落数，计算突变率挑
9、取疑似突变菌落纯培养挑取疑似突变菌落纯培养挑取疑似突变菌落纯培养挑取疑似突变菌落纯培养突变体的初步筛选突变体的初步筛选突变体的初步筛选突变体的初步筛选用简单快捷的方法用简单快捷的方法用简单快捷的方法用简单快捷的方法重复筛选重复筛选重复筛选重复筛选摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验选选选选出出出出突突突突变变变变体体体体（根根根根据据据据情情情情况况况况进进进进行行行行生生生生产产产产试试试试验验验验或或或或重复诱变处理）重复诱变处理）重复诱变处理）重复诱变处理）二、微生二、微生物的诱变物的诱变育种育种三、现代菌种选育技术1、杂交育种：、杂交育种：指两个不同基因型的菌株通过接合使遗
10、传物质重新组指两个不同基因型的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。一般包括以下过程：一般包括以下过程：标记菌株的选择标记菌株的选择异核体的形成异核体的形成杂合二倍体的形成杂合二倍体的形成重组体的转化重组体的转化重组体遗传性状的分析重组体遗传性状的分析2、原生质体融合育种、原生质体融合育种原生质体融合育种原生质体融合育种原生质体融合育种原生质体融合育种 细胞（细胞（A+B）细胞（细胞（AB+）脱壁处理脱壁处理脱壁处理脱壁处理原生质体（原生质体（A+B）原生质体（原生质体（AB+）混合混合加融合剂加融合剂原生质体融合原生质体融
11、合涂平板（原生质体再生）涂平板（原生质体再生）形成菌落形成菌落检出重组子菌落（检出重组子菌落（A+B+）3、基因工程育种、基因工程育种程序：程序：1、目的基因的准备、目的基因的准备2、载体系统、载体系统3、基因与载体连接、基因与载体连接4、转化、转化5、重组体的筛选和表达产物的鉴定、重组体的筛选和表达产物的鉴定防止菌种退化的措施防止菌种退化的措施 1 1控制传代次数控制传代次数 2 2创造良好的培养条件创造良好的培养条件 3 3利用不同类型的细胞进行移种传代利用不同类型的细胞进行移种传代 4 4采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法四、菌种的保藏四、菌种的保藏四、菌种的保藏四、菌种的保藏
12、 1 1低低低低温温温温保保保保藏藏藏藏法法法法 斜斜斜斜面面面面菌菌菌菌种种种种直直直直接接接接放放放放入入入入0 04 4冰冰冰冰箱箱箱箱中中中中保保保保藏藏藏藏，保保保保存存存存时时时时间间间间不不不不宜宜宜宜过过过过长长长长，一一一一般般般般为为为为 3 36 6个个个个月月月月；用用用用-20-20以以以以下下下下的的的的超超超超低低低低温温温温冰冰冰冰箱箱箱箱或或或或干干干干冰冰冰冰、液液液液氮氮氮氮（-195-195）冻冻冻冻结结结结保保保保藏藏藏藏，长长长长达达达达数数数数年。年。年。年。2 2干干干干燥燥燥燥保保保保藏藏藏藏法法法法 主主主主要要要要是是是是指指指指把把把把菌
13、菌菌菌种种种种接接接接种种种种到到到到适适适适当当当当载载载载体体体体上上上上，在在在在干干干干燥燥燥燥条条条条件件件件下下下下进进进进行行行行保保保保藏藏藏藏。这这这这种种种种保保保保藏藏藏藏方方方方法法法法主主主主要要要要适适适适合合合合于于于于细细细细菌菌菌菌的的的的芽芽芽芽胞胞胞胞和和和和霉霉霉霉菌菌菌菌的的的的孢孢孢孢子子子子。细细细细菌菌菌菌芽芽芽芽胞胞胞胞用用用用沙沙沙沙土土土土管管管管保保保保藏藏藏藏；霉霉霉霉菌菌菌菌的的的的孢子多用麸皮管保藏。孢子多用麸皮管保藏。孢子多用麸皮管保藏。孢子多用麸皮管保藏。3 3隔隔隔隔绝绝绝绝空空空空气气气气保保保保藏藏藏藏法法法法 用用用用固
14、固固固体体体体石石石石蜡蜡蜡蜡密密密密封封封封试试试试管管管管口口口口以以以以隔隔隔隔绝绝绝绝空空空空气，气，气，气，4 4真真真真空空空空冷冷冷冷冻冻冻冻干干干干燥燥燥燥保保保保藏藏藏藏法法法法 其其其其基基基基本本本本过过过过程程程程是是是是：培培培培养养养养菌菌菌菌种种种种加加加加菌菌菌菌种种种种保保保保护护护护剂剂剂剂（一一一一般般般般食食食食品品品品工工工工业业业业用用用用菌菌菌菌种种种种多多多多用用用用牛牛牛牛乳乳乳乳作作作作保保保保护护护护剂剂剂剂）分装、预冻分装、预冻分装、预冻分装、预冻真空冻干真空冻干真空冻干真空冻干真空封口。真空封口。真空封口。真空封口。培养基的制备培养基的
15、制备在在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样，采用的工艺也不同，所生化特性不一样，采用的工艺也不同，所需的培养基组成亦各异。即使同一菌种。需的培养基组成亦各异。即使同一菌种。在种子的培养阶段和不同的发酵时期，其在种子的培养阶段和不同的发酵时期，其营养的要求也不完全一样。因此需根据其营养的要求也不完全一样。因此需根据其不同要求来选用培养基的成分和配比。其不同要求来选用培养基的成分和配比。其主要成分包括：碳源、氮源、无机盐类主要成分包括：碳源、氮源、无机盐类（包括微量元素）、（包括微量元素）、前体前体等等培养基各成分说明培养基各成分说明碳源：主要用以供
16、给菌种生命活动所需的能量，构成菌体碳源：主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。有的碳源还参与抗生素的生物合成，是细胞及代谢产物。有的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要成分。培养基中主要成分。氮源：主要用以构成菌体细胞物质和含氮代谢物，亦包括氮源：主要用以构成菌体细胞物质和含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。用以生物合成含氮抗生素。无机盐和微量元素：抗生素产生菌和其他微生物一样，在无机盐和微量元素：抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长。繁殖和产生生物成品过程中，需要某些无机盐类和生长。繁殖和产生生物成品过程中，需要某些无机盐类和微量元素，其浓度与菌种的生理活性
17、有一定的影响。微量元素，其浓度与菌种的生理活性有一定的影响。前体：在抗生素合成中，菌体利用它构成抗生素分子中的前体：在抗生素合成中，菌体利用它构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变的物质称为前体。前体除一部分而其本身又没有显著改变的物质称为前体。前体除参与产物合成，在一定的条件下还控制合成抗生素的方向参与产物合成，在一定的条件下还控制合成抗生素的方向和抗生素的产量。和抗生素的产量。孢子制备孢子制备生产用的菌株需经纯化和生产能力的检验，生产用的菌株需经纯化和生产能力的检验，符合规定的才能用来制备种子。制备孢子符合规定的才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过时，将保
18、藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养固体斜面培养基上，在一定温度下培养57天或天或7天以上，必要时还可以进一步用扁天以上，必要时还可以进一步用扁瓶在固体培养基上扩大培养。瓶在固体培养基上扩大培养。种子制备种子制备其其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养。或者直接将后再接入种子罐进行逐级扩大培养。或者直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。孢子接入
19、种子罐后逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。扩大培养级数通常为二级。发酵发酵发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。素。发酵开始前和整个过程要维持发酵罐的无发酵开始前和整个过程要维持发酵罐的无菌；需不断通入无菌空气和搅拌，维持一菌；需不断通入无菌空气和搅拌，维持一定的罐压或溶氧；并控制罐的温度。定的罐压或溶氧；并控制罐的温度。此外，还要加入消沫剂以控制泡沫，必要此外，还要加入消沫剂以控制泡沫，必要时还要加入酸、碱调整罐内的时还要加入酸、碱调整罐内的pH值。值。作业作业读书笔记：通过现代育种技术对某种抗生读书笔记：通过现代育种技术对某种抗生素产生菌进行菌种选育素产生菌进行菌种选育写明实验材料、目的、方法步骤、结果写明实验材料、目的、方法步骤、结果