第二章种子制备课件.ppt

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1、第二章种子制备第二章种子制备 知识目标1了解常见工业微生物的种类，工业微生物菌种的筛选，微生物选择性分离的原理，重要工业微生物的分离。2理解菌种的选育方法，如诱变育种，抗噬菌体菌株的选育，杂交育种，原生质体融合技术。能力目标1.掌握种子的扩大培养，包括实验室种子制备，生产车间种子制备，基因重组微生物种子培养。2.掌握种子质量的控制，包括影响种子质量的因素及控制，种子异常分析。 第一节第一节 工业微生物菌种概述工业微生物菌种概述 （1）在较短的发酵过程高产有价值的发酵产品（2）菌种的发酵培养基易获得，价格低廉,转化效率高（3）菌种对人、动物、植物和环境没有危害，保证安全（4）菌种发酵后，所产不需

2、要的代谢产物少，产品分离容易（5）菌种不易变异退化，稳定性好一、发酵工业对菌种的要求：二、发酵工业常用的微生物 微生物的代谢产物多达1300多种，而用于大规模工业化生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过4050种。因此，微生物具有巨大的潜力可挖掘。 1.细菌 大肠杆菌大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。 乳酸杆菌乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 应用：生产淀粉酶2. 酵母菌酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪 啤酒酵母的菌落特征啤酒酵母

3、 啤 酒 酵 母 红 酵 母 面包酵母3.霉菌 曲霉黑曲霉应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶 黄曲霉 应用：酱油、酱类（淀粉酶）应用：生产甲义丁二酸米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶 应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作毛毛 霉霉根霉根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒青霉 应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶4.放线菌放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素 应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素第二节第二节 菌种的选育菌种的选育1.自然选育 把菌种制备成单孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板上进行分离，挑取部分单菌落进行

4、生产能力的测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株自然选育的一般步骤 表现形态表现形态目的代谢产物产量目的代谢产物产量遗传基因型纯度遗传基因型纯度传代稳定性传代稳定性从自然界中分离筛选菌种的方法步骤从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 方法、地点、时间和周围环境记录方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1稀释分离法稀释分离法 2平板划线分离法平板划线分离法 涂菌：涂菌： 划线分离：划线分离：分步划线法；分步划线法；一次划线法：一次划线法： 3组织分离法组织分离法 2.诱变育种 指用人工的方法处理微生物，使它们发

5、生突指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变的基本原理诱变剂诱变剂 物理诱变剂物理诱变剂 紫外线、紫外线、XX射线、射线、 射线，快中子射线，快中子 化学诱变剂化学诱变剂 亚硝酸、烷化剂亚硝酸、烷化剂 生物诱变剂生物诱变剂 噬菌体噬菌体诱变机理诱变机理物理诱变剂物理

6、诱变剂紫外线：形成胸腺嘧啶二聚体紫外线：形成胸腺嘧啶二聚体化学诱变剂化学诱变剂碱基突变、染色体畸变碱基突变、染色体畸变 诱变育种步骤诱变育种步骤 出发菌株的选择出发菌株的选择 处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备 诱变处理诱变处理 中间培养中间培养 分离和筛选分离和筛选关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进

7、行生产试验或重复诱变处理）选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）中间培养中间培养 处理方法：处理方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛一个菌落内的可能，形成混

8、杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。选结果的不稳定和将来的菌株退化。分离和筛选筛选分初筛和复筛。 初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异在具体方法上就有差异. .例如：例如： 初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将加复筛者，而

9、将90%90%的菌落淘汰。在数量减少后就要的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。纯化菌株。紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于

10、紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。3.基因工程技术 基因工程技术：是运用体外基因工程技术：是运用体外DNADNA各种操作或修改各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达的方法新的宿主细胞系统内进行复制和表达的方法。基本程序基本程序含目的基因含目的基因DNADNA片段的制备；片段

11、的制备；选择合适的载体；选择合适的载体；带有目的基因的带有目的基因的DNADNA片段与载体在体外连接；片段与载体在体外连接；将重组的将重组的DNADNA分子转入受体细胞，在受体细胞分子转入受体细胞，在受体细胞内扩增；内扩增；筛选出带有重组筛选出带有重组DNADNA分子的转化细胞；分子的转化细胞；表达、鉴定外源基因的表达产物。表达、鉴定外源基因的表达产物。 操作要点操作要点提取目的基因提取目的基因 用密度梯度离心方法分别从供体细胞中提取用密度梯度离心方法分别从供体细胞中提取所需要的所需要的DNADNA即目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，即目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因

12、也可通过化学方法人工合成。目的基因也可通过化学方法人工合成。处理目的基因处理目的基因 在从供体细胞中提取出的目的基因中加入专在从供体细胞中提取出的目的基因中加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定基因并暴露出粘性末端的基因并暴露出粘性末端的DNADNA单链部分。必要时这种粘性末端单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。也可用人工方法合成。对作为载体的细菌质粒或噬菌体对作为载体的细菌质粒或噬菌体DNADNA可采用与处理目的基因同一可采用与处理目的基因同一种类的限制性核酸内切酶进行处理，使其形成并暴露出与目种类的限制性核

13、酸内切酶进行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的粘性末端。的基因相应的粘性末端。体外重组体外重组 将上述分别处理过的目的基因和细菌质粒将上述分别处理过的目的基因和细菌质粒DNADNA片段（或片段（或噬菌体核酸）放在试管中，在较低温度（噬菌体核酸）放在试管中，在较低温度（5 566）下混）下混合合“退火退火”。由于这两种。由于这两种DNADNA是用同一种限制性核酸内切是用同一种限制性核酸内切酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互之间能够酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互之间能够形成氢键，这就是所谓形成氢键，这就是所谓“退火退火”。而相邻的核苷酸，在。而相邻的核苷酸，在DNADNA连接酶

14、的作用下也能形成磷酸二酯键，这样就完成了连接酶的作用下也能形成磷酸二酯键，这样就完成了目的基因与质粒目的基因与质粒DNADNA（或噬菌体（或噬菌体DNADNA）的重组，得到的是）的重组，得到的是一个完整的具有复制能力的环状一个完整的具有复制能力的环状DNADNA重组体，即重组体，即“杂种质杂种质粒粒”（或杂种噬菌体）。（或杂种噬菌体）。载体传递载体传递 即通过载体将供体生物中的遗传基因导入到受即通过载体将供体生物中的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自我复制的能力，一般可利用体细胞内。载体必须具有自我复制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入质粒的转化作用或噬菌

15、体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。受体细胞内。 复制、表达复制、表达 在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，并使受体（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌工程菌”。筛选、繁殖筛选、繁殖 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。 通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基

16、因片段的通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。基因的产物。一、概述一、概述1.1.菌种保藏的目的菌种保藏的目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用。于研究、交换和使用。2. 2. 菌种保藏的原理菌种保藏的原理 挑选典型培养物（挑选典型培养物（typical culturetypical culture）的优良纯种，并创造最有利于休）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，

17、使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。菌种保藏的目的与原理3.菌种保藏采取的措施菌种保藏采取的措施 低温低温 干燥干燥 缺氧缺氧 避光避光 缺乏营养缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白 二二 、常用的菌种保藏方法、常用的菌种保藏方法1.斜面传代保藏法斜面传代保藏法方法：接种适宜斜面培养基方法：接种适宜斜面培养基 培养培养 4保藏保藏 措施：低温：措施：低温：4 适用：各大类适用：各大类 保藏期：保藏期：16个月个月用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间用橡皮塞代替棉塞，可适当延长

18、保藏时间2.液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法 方 法 ： 斜 面 或 半 固 体 接 种方 法 ： 斜 面 或 半 固 体 接 种 培 养培 养 加 无 菌 液 蜡 高 出 培 养加 无 菌 液 蜡 高 出 培 养 基基1cm415保藏保藏 措施：低温，隔氧措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类适用：不能利用石油的各大类 保藏期：保藏期：12年年优点：简便优点：简便斜面菌种冰箱保藏菌种 液体石蜡保藏的菌种3.砂土管保藏法砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中加入无菌砂土管中 干燥干燥 封口封口 保藏保藏 措施：无营养，缺氧，干燥措施：无营养，缺氧，干燥 适用

19、：产孢子（芽孢）微生物适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：保藏期：110年年4.冷冻干燥保藏冷冻干燥保藏 方法：菌种培养方法：菌种培养 用保护剂悬浮用保护剂悬浮 加入安醅管中加入安醅管中低温冻结低温冻结（-25-40）抽真空（至抽真空（至0.01mmHg） 真空封口真空封口 检检查真空度查真空度 保藏保藏 措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类适用：各大类 保藏期：保藏期：515年或更长年或更长5.甘油管保藏法甘油管保藏法 方法：菌种培养方法：菌种培养 1530%甘油缓冲液悬浮甘油缓冲液悬浮 加入保藏管中加入保藏管中 置置 -70冰箱保藏冰箱保藏措施：低

20、温（措施：低温（-70）、保护剂（）、保护剂（1550%甘油）甘油）适用：细菌、酵母菌适用：细菌、酵母菌保藏期：约保藏期：约10年年 6.液氮保藏法液氮保藏法方法：菌种培养方法：菌种培养 保护剂悬浮保护剂悬浮 加入保藏管中加入保藏管中 置液氮瓶中置液氮瓶中 措施：超低温（措施：超低温（-196）、保护剂）、保护剂 适用：各大类适用：各大类保藏期：保藏期：15年年 三、 菌种保藏工艺流程1.选择保藏方法2.配制保藏培养基3.接种培养4.保藏附录：菌种保藏机构附录：菌种保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM中国普通微生物菌种保藏中心中国普通微生物菌种保藏中心C

21、GMCC(归口中国科学院归口中国科学院) 中国科学院微生物研究所中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) 中国农业微生物菌种保藏中心中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院归口中国农业科学院)中国农业科学院土壤与肥料研究所中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) 中国工业微生物菌种保藏中心中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会归口轻工业总会)中国食品发酵工业研究所中国食品发酵工业研究所(IFFI) 中国医学微生物菌种保藏中心中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部归口卫生部) 中国医学科学院皮肤病研究所中国医

22、学科学院皮肤病研究所(ID)，南京，南京 卫生部药品生物制品检定所卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所中国预防医学科学院病毒研究所 中国抗生素微生物菌种保藏中心中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局国家医药管理局) 中国医学科学院医药生物技术研究所中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所四川抗生素研究所(SIA)，四川，四川 华北制药厂抗生素研究所华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄石家庄 中国兽医微生物菌种保藏中心中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部归口农业部) 农业部兽药监察研究所农业部兽药监察研究所(NCIVBP

23、) 中国林业微生物菌种保藏中心中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林归口中国林业科学院业科学院)中国林业科学院林业研究所中国林业科学院林业研究所(RIF) 菌种复壮菌种的衰退菌种的衰退degeneration 生产性状的劣化生产性状的劣化,原有典型性状的不典型等原有典型性状的不典型等 菌落及细胞形态的改变菌落及细胞形态的改变 生长速度缓慢生长速度缓慢 代谢产物生产能力下降代谢产物生产能力下降 致病菌对宿主侵染力下降致病菌对宿主侵染力下降 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱 2.菌种衰退的原因菌种衰退的原因 基因自发突变基因自发突变 退化

24、是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。演变过程。 自发突变率自发突变率加速退化的因素加速退化的因素 传代次数过多传代次数过多 不适宜的培养条件不适宜的培养条件3.防止衰退的措施防止衰退的措施（1）控制传代次数）控制传代次数（2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌：无性孢）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌：无性孢子或有性孢子子或有性孢子（4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法 菌种合理传代方法之一4 菌种的复壮菌种的复壮 rejuven

25、ation 在菌种已发生衰退的在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的恢复原菌株固有性状的相应措施。相应措施。 在菌种的典型特征或在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正以期从中选择到自发的正突变个体。也称突变个体。也称生产育种。生产育种。(1) 纯种分离法纯种分离

26、法 平板表面涂布法平板表面涂布法平板划线分离法平板划线分离法琼脂培养基浇注法琼脂培养基浇注法用用“分离小室分离小室”进行单细胞分离进行单细胞分离用显微操纵器进行单细胞分离用显微操纵器进行单细胞分离用菌丝尖端切割法进行单细胞分离用菌丝尖端切割法进行单细胞分离菌落纯菌落纯（菌种纯）（菌种纯）细胞纯细胞纯（菌株纯）（菌株纯）纯种分离法纯种分离法平板涂布方法平板划线方法(4)(4)淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体 对对S. microflavus“5406”“5406”农用抗生菌农用抗生菌的分生孢子采用的分生孢子采用-10 -30-10 -30的低温处理的低温处理5- 75- 7天，使其死亡率达到天，

27、使其死亡率达到80%80%左右，结果会在抗低左右，结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到复壮的效果复壮的效果 第三节 种子扩大培养一、一、优良种子应具备的条件优良种子应具备的条件1.菌种细胞的生长活力强活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。2.菌种生理性状稳定生理性状稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率等符合要求。3.菌体浓度及总量菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐 的要求。4.无杂菌污染无杂菌污染。5.能保持稳定的生产能力稳定的生产能力。二、种子扩大培养的任务和培养类型1.任务任务： 获得大量大量的活力强活力强的种子，以便在发酵罐的发酵培养

28、过程中尽可能地缩短迟滞期。 扩大培养的级数扩大培养的级数； 放线菌（生产抗生素）三级放大，（其中链霉素须四级扩大）；细菌生长较快，用二级放大培养（斜面菌种一级种子摇床培养二级种子罐培养发酵罐）种子扩大培养流程图1、2-保藏种子 3-斜面 4-摇瓶 5-茄子瓶 6-固体培养 7、8-种子罐 9-发酵罐2.培养类型 实验室种子扩大培养的方法：实验室种子扩大培养的方法：液体培养法（三角瓶摇床振荡或转式培养）；固体培养法 试管 三角瓶 茄子瓶生产车间种子扩大培养的方法园盘制曲机A、固体培养（曲法培养）B、液体培养液体深层培养：液体深层培养： 目前几乎所有的好气发酵均采用此法；第四节第四节 种子质量控制

29、种子质量控制 1.培养基：培养基： 选用原则： 组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。种子培养基是培养菌体的（以菌体增殖菌体增殖为主要目的），应该是糖份少而氮源多些。 但种子罐与发酵罐培养基成分趋于一致时，可缩短发酵生产的周期，但在各成分的数量（原料配比上），应根据培养目的而定。2.种龄与接种量种龄与接种量 种龄种龄：种子培养时间。 一般选择对数期，缩短发酵周期。 接种量接种量：移入的种子液体积与接种后培养液体积比。 多数抗生素的接种量在7%-15%，有时20-25%。依据具 体的发酵类型和工艺条件而定。3.温度：温度： 温度直接影响生长和酶的合成；最适温度最适温度4.pH值：对微生物有明

30、显的影响 各种微生物都有生长的最适pH。培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。调节方法调节方法 (1) 酸碱溶液中和 (2) 缓冲溶液 (3) 生理缓冲剂5.通气搅拌搅拌：搅拌： 促进氧的溶解，营养物质与代谢产物的分散。 通气：通气： 通气量的多少以溶解氧溶解氧来衡定。6.泡沫：危害危害： 影响微生物对氧的吸收。消泡方法：（1） 消泡剂：天然动植物油、石油化工矿物油；改性油，表面活性剂（有机硅聚合物）；（2） 机械消泡：（3）改变培养基成分。7.染菌的控制染菌原因染菌原因： 设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严无菌操作不严、菌种不纯；8.种子罐级数 种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌。作业1.简述大规模工业生产常用的培养方法。2.简述影响种子质量的主要因素。