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1、动物疫病监测采样技术第1页，本讲稿共26页动物疫病监测动物疫病监测定定义：调查动物群体中某种疫病或病原的存物群体中某种疫病或病原的存在情况。在情况。通通过监测可以了解可以了解动物疫病的流行物疫病的流行现状、危状、危害程度、害程度、风险因子和因子和发展展趋势，早期，早期识别疫疫病的爆病的爆发和流行。和流行。根据信息来源分根据信息来源分为：问卷卷调查和和实验室室监测。实验室室监测的关的关键:样品和品和检测技技术。第2页，本讲稿共26页实验室检测技术实验室检测技术病原病原检测：病原本身：病原本身检测，病原特有蛋白，病原特有蛋白检测，病原特有核酸，病原特有核酸检测，动物物试验抗体抗体检测：琼扩，试管凝
2、集，平板凝集，血管凝集，平板凝集，血凝和血凝抑制，中和凝和血凝抑制，中和试验，各种，各种ELISAELISA等。等。在检测技术过关的情况下，监测结果是否具在检测技术过关的情况下，监测结果是否具有代表性，是否能够真实反映出疫病的真实有代表性，是否能够真实反映出疫病的真实情况都与监测样品的采集有重要关系。情况都与监测样品的采集有重要关系。第3页，本讲稿共26页如何做好采样工作送检样品中的问题合格样品如何得到合格样品采样中应注意问题第4页，本讲稿共26页一、样品存在的问题一、样品存在的问题样品的真实性样品的真实性（假样品，一个样品分开）（假样品，一个样品分开）样品的质量（溶血，腐败，反复冻融）样品的
3、质量（溶血，腐败，反复冻融）采样单填写的信息不全（畜禽日龄，免疫情采样单填写的信息不全（畜禽日龄，免疫情况等）况等）组织样品采集的太大，不专业。组织样品采集的太大，不专业。每一种类的样品用一个采样单。每一种类的样品用一个采样单。样品编号不能追溯回去。样品编号不能追溯回去。第5页，本讲稿共26页二、样品的种类二、样品的种类血液样品：血清，全血抗凝血，血浆血液样品：血清，全血抗凝血，血浆组织样品：心肝脾肺肾脑，淋巴结，扁组织样品：心肝脾肺肾脑，淋巴结，扁桃体桃体粪便样品：新鲜，湿润的粪便样品：新鲜，湿润的生殖道和精液样品生殖道和精液样品皮肤样品：皮屑皮肤样品：皮屑分泌液和渗出液样品：舌面或蹄部的水
4、分泌液和渗出液样品：舌面或蹄部的水泡液泡液第6页，本讲稿共26页血液样品血液样品血液：最常用的样品，可以做血清学试验的样品，也可以作为病原学血液：最常用的样品，可以做血清学试验的样品，也可以作为病原学试验的样品。试验的样品。全血（抗凝血）：抗凝剂有肝素，阿氏液，枸橼酸钠和全血（抗凝血）：抗凝剂有肝素，阿氏液，枸橼酸钠和4%EDTA4%EDTA，或者用玻璃珠，脱纤维蛋白。，或者用玻璃珠，脱纤维蛋白。血清：不加抗凝剂的血液，在室温静置血清：不加抗凝剂的血液，在室温静置24h24h（或（或371h371h），待血液完全凝固后，析出上清即为血清。），待血液完全凝固后，析出上清即为血清。血浆：抗凝血混匀
5、后，静置，上清即为血浆。血浆：抗凝血混匀后，静置，上清即为血浆。第7页，本讲稿共26页检测样品的分类检测样品的分类细菌学菌学检测样品：采集品：采集发病典型或病典型或刚死亡的整体死亡的整体动物送物送实验室室为最好。无菌采集，冷藏，保存液中不加任何抗生素。最好。无菌采集，冷藏，保存液中不加任何抗生素。病毒学病毒学检测样品：病毒品：病毒检测应在在动物病初、体温升高期物病初、体温升高期间采集。采集。以以组织脏器、血液、器、血液、粪便等便等样品品为主主 。冷藏或冷。冷藏或冷冻，保存液中加，保存液中加抗生素。抗生素。血清学血清学检测样品：静脉采血品：静脉采血3 ml3 ml左右，注射器内留一定空左右，注射
6、器内留一定空间，静置，静置过程或已凝固的血液程或已凝固的血液应低温冷低温冷冻，以免溶血。短，以免溶血。短时间内，可在内，可在4 4度左右保存；如度左右保存；如时间较长应冻结保存，注意不保存，注意不能反复能反复冻融融.病理学病理学检测样品：保品：保证样品新品新鲜，应选择病病变最典型最明最典型最明显的部位，且的部位，且连同部分健康同部分健康组织一并采集。一并采集。浸泡于酒精或浸泡于酒精或福福尔马林溶液中，冷藏保存和运林溶液中，冷藏保存和运输。第8页，本讲稿共26页几种重要疫病的几种重要疫病的采样时机采样时机禽流感、新城疫：禽流感、新城疫：发病初期采全血，泄殖腔病初期采全血，泄殖腔 咽喉棉咽喉棉拭子
7、；后期采集新拭子；后期采集新鲜粪便；剖剪后的气管，肺便；剖剪后的气管，肺脏，肾脏等等口蹄疫：全血，水泡皮，水泡液，口蹄疫：全血，水泡皮，水泡液，O/PO/P液及口腔分泌物液及口腔分泌物和咽喉棉拭子和咽喉棉拭子猪瘟，猪猪瘟，猪伪狂犬，狂犬，蓝耳病：全血，血清，耳病：全血，血清，组织病料：病料：肺肺脏，脾，脾脏，淋巴，淋巴结，扁桃体，流，扁桃体，流产胎衣等，新胎衣等，新鲜精液或冷精液或冷冻精液精液猪流感：在猪流感：在发热期采集鼻咽棉拭子和肺期采集鼻咽棉拭子和肺组织病料。病料。第9页，本讲稿共26页三、高品质样品的特征三、高品质样品的特征样品标记明确样品标记明确样品新鲜样品新鲜采样单填写规范采样单填
8、写规范样本样本样品数量适当样品数量适当第10页，本讲稿共26页四、如何得到高质量的样品四、如何得到高质量的样品高质量样品采样前准备 采样的时效性 样本的数量样品的标记样品的保存和运输第11页，本讲稿共26页1 1、采、采样前的准前的准备-器具器具采采样工具：一次性注射器，解剖刀，剪刀，工具：一次性注射器，解剖刀，剪刀，镊子，酒精灯，酒子，酒精灯，酒精棉，棉精棉，棉签，保定，保定动物物专用工具用工具样品存放用具：塑料离心管（品存放用具：塑料离心管（1.51.5，2 2，5ml5ml），自封口），自封口样品品袋，袋，试管架，塑料管架，塑料样品盒，胶布，封口膜，冰袋。品盒，胶布，封口膜，冰袋。防防护
9、用具：一次性手套，鞋套，口罩，隔离衣等。用具：一次性手套，鞋套，口罩，隔离衣等。记录用具：不干胶用具：不干胶标签、圆珠笔、油性珠笔、油性记号笔、采号笔、采样单、记录本等本等第12页，本讲稿共26页2、采样前准备、采样前准备采样技术采样技术血液血液样品：牛、品：牛、马、羊从、羊从颈静脉或尾静脉采血；猪从静脉或尾静脉采血；猪从前腔静脉采血，用量少前腔静脉采血，用量少时也可从耳静脉抽取；家禽从也可从耳静脉抽取；家禽从翅静脉抽取。翅静脉抽取。棉拭子棉拭子样品：泄殖腔，咽喉，鼻腔品：泄殖腔，咽喉，鼻腔水泡皮及水泡液：水泡皮及水泡液：O/PO/P液：保定，左手拉出舌液：保定，左手拉出舌头或从嘴的一或从嘴的
10、一侧按住舌按住舌头，右手，右手缓慢放入探杯。慢放入探杯。组织样品：解剖，品：解剖，洁净取取样。第13页，本讲稿共26页血液样品的分离方法血液样品的分离方法抗凝血：采血前在抗凝血：采血前在试管或注射器内按比例加管或注射器内按比例加抗凝抗凝剂，运，运输时必必须减少震减少震荡以免溶血。以免溶血。非抗凝血：分离血清非抗凝血：分离血清血清析出好的因素：容器：玻璃血清析出好的因素：容器：玻璃试管管优于塑于塑料离心管；料离心管；斜面斜面：与空气接触面要大。：与空气接触面要大。温度温度：最佳温度是体温；最佳温度是体温；时间：室温静置最短：室温静置最短2 2小小时；离心离心：转速要低，速要低，20002000转
11、。胶胶冻状血清的成因：采血前状血清的成因：采血前刚刚喂食（没有喂食（没有空腹）；凝血空腹）；凝血时间不不够；脂肪血（；脂肪血（营养养过剩）剩）第14页，本讲稿共26页粪便、棉拭子和便、棉拭子和O/PO/P液液样品品的采集的采集泄殖腔拭子的采集：将棉拭子插入泄殖腔泄殖腔拭子的采集：将棉拭子插入泄殖腔约1.52cm,1.52cm,旋旋转后沾上后沾上粪便。便。咽喉拭子、鼻腔拭子的采集：将咽喉拭子、鼻腔拭子的采集：将灭菌的干棉拭子插入口腔菌的干棉拭子插入口腔至咽的后部或鼻腔，至咽的后部或鼻腔，轻轻擦拭并慢慢旋擦拭并慢慢旋转将拭子拔出，将将拭子拔出，将棉拭子放入棉拭子放入缓冲液内。冲液内。O/PO/P液
12、液是是从从动物物食食道道/咽咽喉喉刮刮取取的的黏黏膜膜样品品，用用特特制制的的食道探食道探环刮取黏膜，放入刮取黏膜，放入样品保存液中。品保存液中。第15页，本讲稿共26页水泡液及水泡皮的采集水泡液及水泡皮的采集用用75%75%酒精消毒水泡表皮，用酒精消毒水泡表皮，用灭菌生理菌生理盐水擦水擦去酒精，用注射器穿刺吸取水泡液，置于含去酒精，用注射器穿刺吸取水泡液，置于含抗生素的抗生素的PBSPBS缓冲液中；然后用剪刀将水泡皮冲液中；然后用剪刀将水泡皮剪下，放入含抗生素的剪下，放入含抗生素的PBSPBS缓冲液中。冲液中。第16页，本讲稿共26页3、采样的准确性和时效性、采样的准确性和时效性代表性：代表
13、性：应该考考虑到整个到整个监测区域的地理分布，区域的地理分布，选取有取有代表性的点。如代表性的点。如动物品种分布、日物品种分布、日龄、饲养密度、地养密度、地势特点、交通特点、特点、交通特点、动物迁徙物迁徙习性等因素。如禽流感采性等因素。如禽流感采样时，疫区交接，疫区交接处，野，野鸟迁徙途径，水禽家禽混合迁徙途径，水禽家禽混合饲养养处等。等。时效性：如抗体效性：如抗体监测，免疫后，免疫后1414天左右才可以采集；天左右才可以采集；监测病病原原时，注意，注意排毒排毒时间和病原的和病原的易嗜易嗜细胞胞和和组织，在，在监测时要根据不同要根据不同时期，采集不同部位的期，采集不同部位的组织进行行检测。如口
14、蹄疫。如口蹄疫病毒首先是在咽喉部和肺上皮病毒首先是在咽喉部和肺上皮细胞胞扩增，然后增，然后进入血液，通入血液，通过分泌物、水泡排毒。分泌物、水泡排毒。第17页，本讲稿共26页样本样本样品的数量样品的数量样本：总体中的一部分代表；样品：检测的原始材料。样本：总体中的一部分代表；样品：检测的原始材料。概率抽样（随机抽样）：概率抽样（随机抽样）：是按照随机原则进行抽样，不加主是按照随机原则进行抽样，不加主观因素，组成总体的每个单位都有被抽中的概率（非零概率）观因素，组成总体的每个单位都有被抽中的概率（非零概率）比例抽样：按养殖规模成比例抽样。比例抽样：按养殖规模成比例抽样。多阶段抽样：全市分区，每个
15、区随机选县，每个多阶段抽样：全市分区，每个区随机选县，每个县选乡镇，每个乡镇选养殖场。县选乡镇，每个乡镇选养殖场。样本量，符合统计学要求，决定因素：疫病在群体中样本量，符合统计学要求，决定因素：疫病在群体中的发生率，可信水平，检测方法的发生率，可信水平，检测方法 的敏感性和特异性。的敏感性和特异性。样品的量要足够检测使用。样品的量要足够检测使用。第18页，本讲稿共26页4.1样品的包装和编号样品的包装和编号单个个样品的包装品的包装动物血清、全血、棉拭子、水泡液，加有物血清、全血、棉拭子、水泡液，加有PBSPBS的的粪便等液体便等液体样品用用品用用1.5ml1.5ml，2ml2ml，5ml5ml
16、带盖的塑料离心管；盖的塑料离心管；组织病料等固体病料等固体样品用自封口品用自封口样品袋，或放入品袋，或放入1.5ml1.5ml及及2ml2ml塑料离塑料离心管；心管；每次送每次送样的同一种的同一种样品品进行行编号，每个号，每个样品都要有唯一品都要有唯一编号，号，标识清楚，不易清楚，不易丢失。失。每每组样品的包装品的包装以以镇或每个采或每个采样点点为单位分位分组，每，每组一个大包装，用自封口一个大包装，用自封口样品袋包装，并品袋包装，并贴有有标签，注明，注明样品名、品名、样品品编号、采号、采样日日期等。期等。第19页，本讲稿共26页4.2样品的记录样品的记录单个样品的小塑料离心管外用油性记号笔标
17、记单个样品的小塑料离心管外用油性记号笔标记每组样品自封袋外用钢笔填写样品标签和封条每组样品自封袋外用钢笔填写样品标签和封条编号与采样单一致，具有唯一性和可追溯性。编号与采样单一致，具有唯一性和可追溯性。填写采样单：被采样畜主的联系方式和采样人的填写采样单：被采样畜主的联系方式和采样人的联系方式；被采样动物的健康状况和免疫状况；联系方式；被采样动物的健康状况和免疫状况；被采样动物的联系方式（畜种，日龄，标识号等）被采样动物的联系方式（畜种，日龄，标识号等）；样品运输方式；日期，签名（采样人，畜主）。；样品运输方式；日期，签名（采样人，畜主）。青岛市动物疫病监测采样单青岛市动物疫病监测采样单每类样
18、品要求填写一份采样单。每类样品要求填写一份采样单。第20页，本讲稿共26页5、样品追溯、样品追溯样品编号和填写采样单目的就是对检测结果的追样品编号和填写采样单目的就是对检测结果的追溯。溯。动物防疫法动物防疫法规定动物免疫抗体监测、动物疫规定动物免疫抗体监测、动物疫病病原监测、动物疫病应急流行病学调查等均实病病原监测、动物疫病应急流行病学调查等均实行可追溯制度。行可追溯制度。追溯内容：家禽来源、追溯内容：家禽来源、饲养周期、防疫情况、免养周期、防疫情况、免疫程序、疫苗及疫程序、疫苗及兽药的使用情况。的使用情况。抗体监测要求追溯到每栋，每舍。抗体监测要求追溯到每栋，每舍。病原学监测必须追溯到每只，
19、每头。病原学监测必须追溯到每只，每头。第21页，本讲稿共26页6.1样品的保存样品的保存血清：血清：4-84-8冷藏，不超过冷藏，不超过2 2周；抗凝血：周；抗凝血：4-4-88冷藏，不超过冷藏，不超过1 1周；周；病毒检验材料：短时间可冷藏，否则须病毒检验材料：短时间可冷藏，否则须-20-20 或或-70-70 以下保存，无条件的可置灭菌以下保存，无条件的可置灭菌50%50%甘油甘油-PBS-PBS液中冷藏，不宜反复冻融。液中冷藏，不宜反复冻融。细菌检验病料：冷藏，不宜冷冻，可置灭菌细菌检验病料：冷藏，不宜冷冻，可置灭菌的的30%30%甘油甘油-PBS-PBS液液/盐水中冷藏。盐水中冷藏。所
20、有冻存样品忌反复冻融所有冻存样品忌反复冻融第22页，本讲稿共26页6.2样品的运输样品的运输关键是：容器（密闭）温度（低温）时间（越快越好）关键是：容器（密闭）温度（低温）时间（越快越好）容器：密封容器，防止渗漏，造成环境污染或疫情扩散。容器：密封容器，防止渗漏，造成环境污染或疫情扩散。温度：样品应在低温下保存和运输（放置冰块）。温度：样品应在低温下保存和运输（放置冰块）。拭子样品和组织样品应作暂时的冷藏或冷冻处理，然拭子样品和组织样品应作暂时的冷藏或冷冻处理，然后运送。血清样品，若后运送。血清样品，若 24h24h内运达实验室，冷藏运输；内运达实验室，冷藏运输；若超过若超过 24h24h，要
21、先冷冻后，再冷藏运输，途中不能超，要先冷冻后，再冷藏运输，途中不能超过过 48h48h。时间：若能在时间：若能在4h4h内送到实验室，可用冰袋冷藏运输。如果超内送到实验室，可用冰袋冷藏运输。如果超过过4h4h，应置于，应置于-30-30 作冷冻处理，再在保温箱内加冰袋运输，作冷冻处理，再在保温箱内加冰袋运输，在在24h24h内送到。若内送到。若 24h24h不能送到实验室，则运输过程中环境不能送到实验室，则运输过程中环境温度应保持在温度应保持在-20-20 以下（干冰）。以下（干冰）。第23页，本讲稿共26页样品运品运输保存液保存液25255050甘油生理甘油生理盐水水PH 7.2PH 7.2
22、7.67.6的肉的肉汤HanksHanks液、液、MEMMEM培养基（双抗）培养基（双抗）含双抗的含双抗的PBSPBS缓冲液冲液第24页，本讲稿共26页五、采样时注意事项五、采样时注意事项注意人畜共患病：做好自身防护，不直接接触动注意人畜共患病：做好自身防护，不直接接触动物样品。物样品。注意人为的传播疫病：采样工具和防护用品，随身带注意人为的传播疫病：采样工具和防护用品，随身带走，统一消毒。走，统一消毒。采样动物的健康状况（饮食，免疫，用药等）采样动物的健康状况（饮食，免疫，用药等）采集的病料应该包装好，防止污染环境，防止无意的采集的病料应该包装好，防止污染环境，防止无意的传播疾病，做好环境消毒和病害肉的处理。传播疾病，做好环境消毒和病害肉的处理。对于突发事件中急性死亡的动物，如怀疑是炭疽，对于突发事件中急性死亡的动物，如怀疑是炭疽，不能随意解剖，可以采血，或局部解剖做触片。不能随意解剖，可以采血，或局部解剖做触片。第25页，本讲稿共26页谢谢大家！谢谢大家！第26页，本讲稿共26页