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1、实验五简单染色与革兰氏染色第1页，本讲稿共14页一一 实验目的实验目的1 1、学习微生物涂片、染色的操作技术；、学习微生物涂片、染色的操作技术；2 2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；3 3、初步掌握无菌操作技术；、初步掌握无菌操作技术；4 4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。第2页，本讲稿共14页二二 实验原理实验原理简单染色简单染色常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌
2、着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。第3页，本讲稿共14页革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质性细菌的
3、细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇含量低，用乙醇(或丙酮或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，溶解，
4、细胞壁透性增大，使结晶紫使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。染上复染剂的红色。二二 实验原理实验原理革兰氏染色革兰氏染色第4页，本讲稿共14页三 实验材料n培养培养2424小时的大肠杆菌（小时的大肠杆菌（E.coliE.coli），金黄色葡萄），金黄色葡萄球菌球菌;n每个小组从土壤中分离得到的菌种；每个小组从土壤中分离得到的菌种；n载玻片载玻片接种环接种环酒精灯及火柴酒精灯及火柴结晶紫染色液结晶紫染色液碘液碘液9595乙醇乙醇番红染色液番红染色液吸水纸吸水纸显微显微镜。镜。第5页，本讲稿共14页四四
5、 实验步骤实验步骤简单染色制片制片染色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检第6页，本讲稿共14页（1 1）制片：）制片：取菌种培养物取菌种培养物常规涂片常规涂片、自然干燥、加热固、自然干燥、加热固 定；定；（2 2）染色：）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色红染色1-2min1-2min。（3 3）水洗：）水洗：用水洗去涂片上的染色液。用水洗去涂片上的染色液。（4 4）干燥：）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。干。（5 5）镜检：）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野先低倍观察，再高
6、倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。油滴中仔细调焦观察细菌的形态。注意无菌操注意无菌操作作第7页，本讲稿共14页第8页，本讲稿共14页 制片制片初染初染（结晶紫（结晶紫1min）水洗水洗媒染媒染（碘液（碘液1min）水洗水洗脱脱色色（乙醇（乙醇20-30s）水洗水洗复染复染（番红（番红2min）水洗水洗干燥干燥观察观察 n革兰氏染色第9页，本讲稿共14页第10页，本讲稿共14页实验结实验结果果第11页，本讲稿共14页实验完毕后的处理实验完毕后的处理 将浸过油的镜头按下述方法
7、擦拭干净：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许用擦镜纸沾少许乙醚乙醚-乙醇混合乙醇混合液将镜头擦液将镜头擦2-3次。次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。回收容器内。第12页，本讲稿共14页五 注意事项1 1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜
8、少，涂片要均匀，菌、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。膜宜薄。2 2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。3 3、染色过程中勿使染色液干涸。、染色过程中勿使染色液干涸。4 4、选用幼龄的细菌。、选用幼龄的细菌。5 5、用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞；、用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞；6 6、滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡；、滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡；7 7、盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。、盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。第13页，本讲稿共14页六 思考n1、简单染色和革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？n2、绘制简单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。n3、简单染色和革兰氏染色的原理？第14页，本讲稿共14页