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1、实验五氨基酸的分离鉴定滤纸层析法第1页，本讲稿共21页一、实验目的一、实验目的 通过氨基酸的分离，学习纸通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作技术。层析法的基本原理及操作技术。第2页，本讲稿共21页二、实验原理二、实验原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中的分配法。利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离。系数不同而得到分离。展层剂由有机溶剂与水组成。在纸上，水被吸附展层剂由有机溶剂与水组成。在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，当有机相沿纸流动在纤维素的纤维之间形成固定相，
2、当有机相沿纸流动经过层析斑点时，层析点上的溶质就在有机相和水相经过层析斑点时，层析点上的溶质就在有机相和水相之间进行分配。当有机相不断流动时，溶质就沿着有之间进行分配。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动方向移动，不断进行分配，溶质中各组分的机相流动方向移动，不断进行分配，溶质中各组分的分配系数不同，移动速率不同，因而彼此分开。分配系数不同，移动速率不同，因而彼此分开。第3页，本讲稿共21页 各组分由于移动速度不同，物质被分离后在层析纸各组分由于移动速度不同，物质被分离后在层析纸上的位置也不同，可用上的位置也不同，可用Rf 值来表示：值来表示：原点到层析点中心距离原点到层析点中心距离 Rf
3、 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某物质的在一定的条件下某物质的Rf值是常数，可作为定值是常数，可作为定性分析的依据。性分析的依据。Rf 值大小与样品物质的值大小与样品物质的结构性质结构性质、溶剂溶剂系统系统、层析滤纸的质量及、层析滤纸的质量及展层方式展层方式、温度、样品溶液中的、温度、样品溶液中的 杂质等因素有关。杂质等因素有关。第4页，本讲稿共21页物质结构与性质l物质的极性大小决定了物质在水和有机物质的极性大小决定了物质在水和有机相之间的分配情况，其极性的大小主要相之间的分配情况，其极性的大小主要取决于物质所具有的极性基团的性质和取决于物质所具有的极性基团的性质和
4、数量，在极性基团不改变情况下，非极数量，在极性基团不改变情况下，非极性基团成分越多，则分子极性越低等。性基团成分越多，则分子极性越低等。第5页，本讲稿共21页展层方式展层方式l上行法上行法l下行法下行法l环形法环形法(辐射法）辐射法）第7页，本讲稿共21页三、器材 层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸层析滤纸第8页，本讲稿共21页四、试剂四、试剂 1、扩展剂：按体积、扩展剂：按体积4:1:3的正丁醇：冰醋酸：水的正丁醇：冰醋酸：水混合后倒入分液漏斗中，充分振荡，静置后混合后倒入分液漏斗中，充分振荡，静置后分层排出水相分层排出水相 50 ml/组组 2、平衡剂
5、：取漏斗中的扩展剂、平衡剂：取漏斗中的扩展剂5ml 于烧杯中作于烧杯中作平衡剂。平衡剂。3、氨基酸：、氨基酸：0.5%赖、脯、缬、苯丙、亮氨酸溶赖、脯、缬、苯丙、亮氨酸溶液及各组分的混合氨基酸各液及各组分的混合氨基酸各5ml。4、显色剂：显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。水合茚三酮正丁醇溶液。200ml 全班全班 第9页，本讲稿共21页五、操作五、操作 1、取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘、取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2-3cm处用铅笔画一处用铅笔画一条直线，在此线上每间隔条直线，在此线上每间隔2cm作一记号（即原点）作一记号（即原点）如图如图。2、点样：用钢笔或毛细管将氨基酸样品分别
6、点在这、点样：用钢笔或毛细管将氨基酸样品分别点在这6个个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径不超位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径不超3mm。点样量应根据样品的性质及滤纸的长度来决定，一点样量应根据样品的性质及滤纸的长度来决定，一般点样量为般点样量为530ug。第10页，本讲稿共21页溶剂前沿溶剂前沿层析点层析点 原点原点 第11页，本讲稿共21页3、平衡：点样好的滤纸卷成圆筒状用线缝好、平衡：点样好的滤纸卷成圆筒状用线缝好与盛有平衡剂的小烧杯，置于密闭的层析缸与盛有平衡剂的小烧杯，置于密闭的层析缸中，平衡中，平衡1-2小时。小时。4、扩展：将盛有约、扩展：将盛有约20ml左右扩
7、展剂的培养皿左右扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，密闭好层析缸。待溶剂上升到培养皿中，密闭好层析缸。待溶剂上升到1520cm时即取出滤纸，立即用铅笔描出时即取出滤纸，立即用铅笔描出溶济前沿，吹风机或烘箱干燥。溶济前沿，吹风机或烘箱干燥。第12页，本讲稿共21页图1-2 滤纸缝合示意图第13页，本讲稿共21页第14页，本讲稿共21页第15页，本讲稿共21页 5、显色显色：用喷雾器均匀喷上：用喷雾器均匀喷上0.1%的茚三酮的茚三酮正丁醇溶液，干燥。正丁醇溶液，干燥。6、计算：用铅笔描出各层析斑点的轮廓，、计算：用铅笔描出各层析斑点的
8、轮廓，并计算各氨基酸的并计算各氨基酸的Rf 值。值。第16页，本讲稿共21页图谱显示图谱显示l化学方法化学方法：显色剂不与滤纸起反应，挥发性小，易于去除，含水量少。l物理方法物理方法l微生物方法微生物方法l同位素和放射自显影法同位素和放射自显影法第17页，本讲稿共21页注意事项：注意事项：1、要保证层析滤纸不被污染，特别是从点、要保证层析滤纸不被污染，特别是从点样线到溶剂前沿的部分。样线到溶剂前沿的部分。2、各氨基酸样品点样时量要均匀。、各氨基酸样品点样时量要均匀。3、在缝滤纸时，纸的两边不能接触。、在缝滤纸时，纸的两边不能接触。4、点样的一端朝下，扩展剂的液面需低、点样的一端朝下，扩展剂的液面需低于点样线于点样线1cm。第18页，本讲稿共21页第19页，本讲稿共21页六、实验结果样品aa标样Rf混合aaRf差值赖aa脯aa缬aa苯丙aa亮aa第20页，本讲稿共21页七、分析讨论第21页，本讲稿共21页