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1、实验五离子交换柱层析法分离氨基酸第1页，本讲稿共33页目的要求（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。（2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。第2页，本讲稿共33页一、原理离 子 交 换 层 析 是 用 离 子 交 换 剂（具 有 离 子交 换 性 能 的 物 质）作 固 定 相，利 用 它 与 流 动相 中 的 离 子 能 进 行 可 逆 的 交 换 性 质 来 分 离 离子型化合物的层析方法。即 溶 液 中 的 离 子 同 离 子 交 换 剂 上 功 能 基 团交换反应的过程。第3页，本讲稿共33页第4页，本讲稿共33页第5页，本讲稿共33页 带 电 荷 量 少，亲 和 力 小
2、的 先 被 洗 脱下 来，带 电 荷 量 多，亲 和 力 大 的 后 被洗脱下来。第6页，本讲稿共33页离子交换过程示意：起始 吸附 解吸 完成 x+:起始缓冲离子 y+：待分离离子 z+：待分离离子第7页，本讲稿共33页二、离子交换剂的种类v 在 惰 性 载 体 上 引 入 带 有 电 荷 的 活 性 基 团 即 离子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换第8页，本讲稿共33页（二）按载体种类不同1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯 乙 烯+二 乙 烯 苯 聚 苯 乙 烯（单体）（交联剂）二乙烯苯交联度=100%苯
3、乙烯+二乙烯苯第9页，本讲稿共33页v 交 联 度 大，网 孔 变 小，大 分 子 量 的 离 子 不 能进入树脂颗粒内发生离子交换。v 在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性。第10页，本讲稿共33页目数：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为20-50 目Dowex 20 840 m 50 297 m 100 149 m（代表二乙烯苯的百分含量）第11页，本讲稿共33页树脂resin（据所含交换基团的性质分）阳离子交换树脂 强酸型 含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型 含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型 含酚基、羧基阴离子交换树脂 强碱
4、含季胺基团-N+(CH3)3 弱碱 含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2 阴 离 子 交 换 树 脂 对 化 学 试 剂 及 热 都 不 如 阳 离子交换树脂稳定。第12页，本讲稿共33页2.离子交换纤维素v 阴 离 子 交 换 纤 维 素 如:DEAE-纤 维 素 pH8.6 以 下 分 离 中 性 或 酸 性 物 质,具 二 乙胺乙基v 阳离子交换纤维素如:CM-纤维素 一般pH4 条件下使用,具有羧甲基 第13页，本讲稿共33页3.离子交换凝胶 分离大分子物质如：葡 聚 糖（Sephadex）、聚 丙 烯 酰 胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）第14页，本讲稿共33页三、操作注意点（
5、一）离子交换剂的选择原 则：根 据 被 分 离 物 质 的 性 质 选 择 同 一 性 质离 子 交 换 剂 中 选 用 对 被 分 离 物 质 各 组 分 之 间结 合 力 差 异 大 的 型 号 交 换 剂，以 保 证 通 过 离子交换层析后能得到比较满意的结果。第15页，本讲稿共33页考虑因素：1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量第16页，本讲稿共33页根据分离过程的实验条件 强酸强碱应用广泛 弱酸型只能在碱性pH 范围内使用 弱碱型只能在酸性pH 范围内使用第17页
6、，本讲稿共33页（二）缓冲液的选择原 则：不 能 发 生 化 学 反 应，所 带 电 荷 应 与 样 品一致。避免使样品变性第18页，本讲稿共33页(三)洗脱剂 原 则：所 用 洗 脱 液 比 吸 着 物 质 具 有 更 活 泼的离子或基团改变pH 或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱第19页，本讲稿共33页四、应用分 离 多 肽 蛋 白、氨 基 酸、核 酸 及 其 他带电的生物分子第20页，本讲稿共33页离子交换层析法分离氨基酸及测定第21页，本讲稿共33页 原理 所 用 样 品 为 天 冬 氨 酸 和 赖 氨 酸 的 混 合 液，分
7、 别 属 酸 性 氨 基 酸(pI2.77)、碱 性 氨 基 酸(pI9.74)，在 缓 冲 溶 液 中 分 别 带 正 电 荷 和 负电 荷，与 强 酸 型 阳 离 子 交 换 树 脂Dowex50 亲和 力 有 很 大 不 同，在 一 定 的 洗 脱 条 件 下 洗 脱，将 它 们 分 离。利 用 氨 基 酸 可 与 茚 三 酮 反 应 生成有色化合物进行氨基酸鉴定。第22页，本讲稿共33页紫色物质，用于 氨基酸的比色测定和纸层析显色与水含茚三酮的反应：第23页，本讲稿共33页v Asp Lysv pH4.2v pH 10第24页，本讲稿共33页 器材1.层析柱等2.沸水浴第25页，本讲稿
8、共33页 试剂v Dowex50 v 2mol/L NaOHv pH5.3 柠檬酸缓冲液v 样品液：氨基酸混合液v 茚三酮混合液第26页，本讲稿共33页实验步骤1树脂的处理将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。2装柱 取直径1cm,长度1012cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至810cm的高度即可。v 装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面
9、不低于树脂。第27页，本讲稿共33页3平衡将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留34cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。4.加样揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面12mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高34cm左右，接恒流泵。5.洗脱以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集6080管。第28页，本讲稿共33页6洗脱及氨基酸的鉴定向各管收集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热5min后冷却至室温，再加入3mL的0.1%硫酸铜溶液。混匀，以收集液第2管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。第29页，本讲稿共33页实验结果根据氨基酸的解离性质，分析该实验条件下氨基酸从层析柱洗脱下来的顺序。第30页，本讲稿共33页Separationofaminoacidsonacationexchangecolumn第31页，本讲稿共33页注意事项在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。第32页，本讲稿共33页第33页，本讲稿共33页