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1、反胶束萃取第1页，本讲稿共29页10.1 反胶束溶液形成的条件和特性反胶束溶液形成的条件和特性优点优点：从所得结果来看，反胶束萃取具有成本低、溶剂可：从所得结果来看，反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。此外，反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。此外，反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质(胞内胞内酶酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成反胶束在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直
2、接从整细胞中提取蛋白质和酶。可见，反胶束萃取技术为蛋从整细胞中提取蛋白质和酶。可见，反胶束萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径。白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径。反胶束溶液的概念：反胶束溶液的概念：反胶束溶液是透明的、热力学稳定的反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。反胶束系统。反胶束(reversed micelle)是表面活性剂分散于连续是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以表面活表面活性剂性剂是反胶束溶液形成的关键是反胶束溶液形成的关键。第2页，本讲稿共29页10.1.1 10
3、.1.1 表面活性剂表面活性剂表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见表常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见表10.110.1。在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸2乙基己基磺酸钠，结构式见图第3页，本讲稿共29页这种
4、表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为束较大，半径为170170nmnm，有利于大分子蛋白质进入。常使用有利于大分子蛋白质进入。常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下：的阳离子表面活性剂名称和结构如下：(1)CTAB(cetyl-methyl-ammonium bromide)溴化十六烷溴化十六烷基三甲胺基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴十六烷基三甲基胺溴(2)DDAB(didodecyldimethyl ammonium
5、 bromide)溴化十溴化十二烷基二甲铵二烷基二甲铵第4页，本讲稿共29页(3)TOMAC(triomethyl-ammonium chloride)氯化三辛基氯化三辛基甲铵甲铵 将阳离子表面活将阳离子表面活性剂如性剂如CTABCTAB溶于有溶于有机溶剂形成反胶束机溶剂形成反胶束时，与时，与AOTAOT不同，还不同，还需加入一定量的助溶需加入一定量的助溶剂剂(助表面活性剂助表面活性剂)。这是因为它们在结构这是因为它们在结构上的差异造成的。上的差异造成的。第5页，本讲稿共29页10.1.2 临界胶束浓度临界胶束浓度(Critical Micelle Concentration CMC)临界胶束
6、浓度临界胶束浓度,是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。结构、溶剂、温度和压力等因素有关。CMC的数值可通过的数值可通过测定各种物理性质的突变测定各种物理性质的突变(如表面张力、渗透压等如表面张力、渗透压等)来确定。来确定。由于实验方法不同，所得的由于实验方法不同，所得的CMC值往往难于完全一致，但值往往难于完全一致，但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用CMC范围来范围来表示更为方便。
7、表示更为方便。10.1.3 胶束与反放束的形成胶束与反放束的形成将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束称为正常胶束(normal micelle)。结构示意见图结构示意见图a。在胶束在胶束中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外，与中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外，与第6页，本讲稿共29页水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核
8、心、在此核心可水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物质。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，以溶解非极性物质。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度并使其浓度超过临界胶束浓度(CMC)，便会在有机溶剂内形成便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束，其结构示意见图聚集体，这种聚集体称为反胶束，其结构示意见图b。在反胶在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核(po1ar core)。此极
9、性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了了“水池水池”(water pool)。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此进入此“水池水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况示意于图中。后的情况示意于图中。第7页，本讲稿共29页bac反胶团
10、的大小与溶剂和表面活性剂的种类与浓度、温度、离子反胶团的大小与溶剂和表面活性剂的种类与浓度、温度、离子强度等因素有关，一般为强度等因素有关，一般为520nm，其内水池的直径其内水池的直径d用下式用下式计算计算第8页，本讲稿共29页d=6W0MsurfNW0有机相中水与表面活性剂的摩尔比，称为含有机相中水与表面活性剂的摩尔比，称为含水率（水率（water content）M，分别为水的相对分子质量和密度分别为水的相对分子质量和密度 surf界面处一个表面活性剂分子的面积界面处一个表面活性剂分子的面积N阿佛加德罗常数阿佛加德罗常数常用于制备反胶团溶液的表面活性剂是二常用于制备反胶团溶液的表面活性剂
11、是二(2(2乙基己基乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠，琥珀酸酯磺酸钠，AOT在异辛烷中形成的反胶团直径在异辛烷中形成的反胶团直径(d)可可用下述经验式推算用下述经验式推算d=0.3W0+0.24 (nm)第9页，本讲稿共29页式中右侧第一项为反胶团的水核直径，第二项式中右侧第一项为反胶团的水核直径，第二项(2.4nm)为为AOT分子长度的二倍。一般反胶团的分子长度的二倍。一般反胶团的W0不超过不超过40。因此，。因此，AOT形成的反胶团水核直径一般不超过形成的反胶团水核直径一般不超过l 2nm，其中大致可其中大致可容纳一个直径为容纳一个直径为510 nm的蛋白质。当蛋白质分子与反胶的蛋白质。当蛋白质分
12、子与反胶团直径相比大得多时团直径相比大得多时(例如，当相对分子质量超过例如，当相对分子质量超过100200kD)，难于溶解到反胶团中。难于溶解到反胶团中。当反胶团的含水率当反胶团的含水率W0较低时，较低时，反胶团水池内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，以反胶团水池内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，以AOT为表面活性剂，当为表面活性剂，当W06-8时，反胶团内微水相的水分时，反胶团内微水相的水分子受表面活性剂亲水基团的强烈束缚，表观粘度上升子受表面活性剂亲水基团的强烈束缚，表观粘度上升50倍，倍，疏水性也极高。随疏水性也极高。随W0的增大，这些现象逐渐减弱，当的增大，这些现象逐渐减弱，当W
13、016时，微水相的水与正常的水接近，反胶团内可形成双电层。但时，微水相的水与正常的水接近，反胶团内可形成双电层。但即使当即使当W0值很大时，水池内水的理化性质也不能与正常的水完值很大时，水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同，特别是在接近表面活性剂亲水头的区域内。全相同，特别是在接近表面活性剂亲水头的区域内。第10页，本讲稿共29页10.1.4 反胶团的溶解作用反胶团的溶解作用由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。因等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。因此，反胶团萃取可
14、用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的此，反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。关于反胶团溶解分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。关于反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出了四种模型，如图所示蛋白质的形式，有人提出了四种模型，如图所示。其中其中(a)为水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反为水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁胶团壁(表面活性剂表面活性剂)隔开；隔开；(b)蛋白质分子表面存在强烈疏水蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触；区域，该疏水区域直接与有机相接触；(c)蛋白质吸附于反蛋白质吸附
15、于反胶团内壁；胶团内壁；(d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解溶解”。表。表面性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反胶团相面性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反胶团相，但对于亲水性蛋白质，目前普遍接受的是水壳模型。但对于亲水性蛋白质，目前普遍接受的是水壳模型。第11页，本讲稿共29页因为许多实验数据均间接地证明了水壳模型的正确性。例如：因为许多实验数据均间接地证明了水壳模型的正确性。例如：(1)反胶团内酶的结构和活性与反胶团内酶的结构和活性与W0值密切相关，说明酶对其
16、值密切相关，说明酶对其周围存在的水层非常敏感；周围存在的水层非常敏感；(2)反胶团内酶反应动力学行为与反胶团内酶反应动力学行为与在正常的水相中相似，活性与在正常的水相中相似，活性与pH的关系同样表现为钟状曲的关系同样表现为钟状曲线。线。bcda反胶团的溶解作用反胶团的溶解作用第12页，本讲稿共29页10.2 反胶束萃取蛋白质的基本原理反胶束萃取蛋白质的基本原理10.2.1 三元相图及萃取蛋白质三元相图及萃取蛋白质 对一个由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系对一个由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统，存在有多种共存相，可用三元相图表示，图是水统，存在有多种共存相，可用三元相图表
17、示，图是水AOT异辛烷系统的相图示例，从图中可知，能用于蛋白异辛烷系统的相图示例，从图中可知，能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分质分离的仅是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分为平衡的两相：一相是含有极少量有机溶剂和表面活性剂的为平衡的两相：一相是含有极少量有机溶剂和表面活性剂的水相；另一相是作为萃取剂的反胶束溶液。这共存的两相组水相；另一相是作为萃取剂的反胶束溶液。这共存的两相组成，用系线成，用系线(图中虚线图中虚线)相连。这一体系的物理化学性质非常相连。这一体系的物理化学性质非常适合于萃取操作，因为界面张力在适合于萃取操作，因为界面张力在0.12mN/m范围
18、内，密度范围内，密度差为差为10-20，反胶束溶液粘度适中，大约为，反胶束溶液粘度适中，大约为1mPas这一数这一数量级。蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观量级。蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相两相(有机相和水相有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生白质发生第13页，本讲稿共29页静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取，其萃取过程和萃取后的情况见图，的萃取
19、，其萃取过程和萃取后的情况见图，改变水相条件改变水相条件(如如pH值和离子种类及其强度等值和离子种类及其强度等)又可使蛋白质由有机相重新返又可使蛋白质由有机相重新返回水相实现反萃取过程。回水相实现反萃取过程。水水AOT异辛烷系统相图异辛烷系统相图反胶束萃取蛋白质的示意团反胶束萃取蛋白质的示意团第14页，本讲稿共29页10.2.2 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与分配特性蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与分配特性 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括表面活性剂与蛋白蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和位阻效应。质的静电作用力和位阻效应。(1)(1)静电作用力：静电作用力
20、：在反胶束萃在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种推动力。其中一个最直接的因素是作用肯定是萃取过程中的一种推动力。其中一个最直接的因素是pHpH值，它决定了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电值，它决定了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。当荷。当pHpI时，蛋白质呈电中性；时，蛋白质呈电中性；pHpI时，蛋白质带正时，蛋白质带正电荷；电荷；pHpI时，蛋白质带负电荷，即随着时，蛋白质带负电荷，即随着pH的改变，被萃的改变，被萃取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的。因此，如果静
21、取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的。因此，如果静电作用是蛋白质增溶过程的主要推动力，对于阳离子表面电作用是蛋白质增溶过程的主要推动力，对于阳离子表面活性剂形成的反胶束体系，萃取只发生在水溶液的活性剂形成的反胶束体系，萃取只发生在水溶液的pHpI时，此时蛋白质与表面活性剂极性头间相互吸引，而时，此时蛋白质与表面活性剂极性头间相互吸引，而pHpI时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取，对于时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取，对于10.2.2.1 推动力推动力第15页，本讲稿共29页阴离子表面活性剂形成的反胶束体系，情况正好相反。此外，阴离子表面活性剂形成的反胶束体系，情况正好相反。此外，离子型表面活性剂的反
22、离子并不都固定在反胶束表面，对于离子型表面活性剂的反离子并不都固定在反胶束表面，对于AOT反胶束，约有反胶束，约有30的反离子处于解离状态，同时，在反的反离子处于解离状态，同时，在反胶束胶束“水池水池”内的离子和主体水相中的离子会进行交换，这样，内的离子和主体水相中的离子会进行交换，这样，在萃取时会同蛋白质分子竞争表面活性剂离子，从而降低了蛋白在萃取时会同蛋白质分子竞争表面活性剂离子，从而降低了蛋白质和表面活性剂的静电作用力。另一种解释则认为离子强度质和表面活性剂的静电作用力。另一种解释则认为离子强度(盐浓盐浓度度)影响蛋白质与表面活性剂极性头之间的静电作用力是由于离解影响蛋白质与表面活性剂极
23、性头之间的静电作用力是由于离解的反离子在表面活性剂极性头附近建立了双电层，称为德拜屏蔽，的反离子在表面活性剂极性头附近建立了双电层，称为德拜屏蔽，从而缩短了静电吸引力的作用范圈，抑制了蛋白质的萃取，因此从而缩短了静电吸引力的作用范圈，抑制了蛋白质的萃取，因此在萃取时要尽量避免后者的影响。在萃取时要尽量避免后者的影响。(2)(2)位阻效应位阻效应 许多亲水性物质，如蛋白质、核酸及氨基酸等，都许多亲水性物质，如蛋白质、核酸及氨基酸等，都可以通过溶入反胶束可以通过溶入反胶束“水池水池”来达到它们溶于非水溶剂中的目的，来达到它们溶于非水溶剂中的目的，但是反胶束但是反胶束“水池水池”的物理性的物理性(大
24、小、大小、第16页，本讲稿共29页形状等形状等)及其中水的活度是可以用及其中水的活度是可以用W0的变化来调节的，并且会的变化来调节的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的目的，影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。这就是所谓的位阻效应。10.2.2.2 反胶束萃取中蛋白质的分配特性反胶束萃取中蛋白质的分配特性蛋白质在两相间的分配系数蛋白质在两相间的分配系数反胶束浓度反胶束浓度M与表面活性剂浓度与表面活性剂浓度Ssurf的关系为的关系为M=Ssurf/N(N为聚焦数为聚焦数)第17页，本讲稿共29页10.2.3 反胶束萃取蛋白质的动力学反胶
25、束萃取蛋白质的动力学萃取过程中，蛋白质在互不相溶的两相间的传递可分为三步：萃取过程中，蛋白质在互不相溶的两相间的传递可分为三步：蛋白质从水溶液主体扩散到界面；在界面形成包容蛋白质的反蛋白质从水溶液主体扩散到界面；在界面形成包容蛋白质的反胶束；含有蛋白质的反胶束在有机相中扩散离开界面。反萃取胶束；含有蛋白质的反胶束在有机相中扩散离开界面。反萃取过程则相反，含有蛋白质的反胶束从有机相主体扩散到界面；过程则相反，含有蛋白质的反胶束从有机相主体扩散到界面；包容蛋白质的反胶束在界面崩裂；蛋白质从界面扩散到水溶液包容蛋白质的反胶束在界面崩裂；蛋白质从界面扩散到水溶液主体。蛋白质进入或离开反胶束相的传递通量
26、可用下式计算：主体。蛋白质进入或离开反胶束相的传递通量可用下式计算：萃取过程反萃取过程第18页，本讲稿共29页10.3 影响反胶束萃取蛋白质的主要因素影响反胶束萃取蛋白质的主要因素上式上式蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以，任何可以增强这种静电电作用，以及反胶束的大小有关，所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。影响反胶束萃取蛋白质的主要因素，见下表，只要通过对这些因影响反胶束萃取蛋白质
27、的主要因素，见下表，只要通过对这些因素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋白质萃取率，从而达到分离纯化的目的。白质萃取率，从而达到分离纯化的目的。第19页，本讲稿共29页10.3.1 水相水相pH值对萃取的影响值对萃取的影响水相的水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态、从而对萃取过值决定了蛋白质表面电荷的状态、从而对萃取过程造成影响。只有当反胶束内表面电荷，也就是表面活性剂程造成影响。只有当反胶束内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者产生静极性基团所带的电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者
28、产生静电引力，蛋白质才有可能进入反胶束。故电引力，蛋白质才有可能进入反胶束。故第20页，本讲稿共29页对于阳离子表面活性剂、溶液的对于阳离子表面活性剂、溶液的pH值需高于蛋白质的值需高于蛋白质的pI值，值，反胶束萃取才能进行；对于阴离子表面活性剂，当反胶束萃取才能进行；对于阴离子表面活性剂，当pHpI时，时，萃取率几乎为零，当萃取率几乎为零，当pHpI时，萃取率急剧提高，这表明蛋时，萃取率急剧提高，这表明蛋白质所带的净电荷与表面活性剂极性头所带电荷符号相反，两白质所带的净电荷与表面活性剂极性头所带电荷符号相反，两者的静电作用对萃取蛋白质有利，如果者的静电作用对萃取蛋白质有利，如果pH值很低，在
29、界面上值很低，在界面上会产生白色絮凝物，并且萃取率也降低这种情况可认为会产生白色絮凝物，并且萃取率也降低这种情况可认为是蛋白质变性之故。水相是蛋白质变性之故。水相pH值对几种相对分子质量较小的值对几种相对分子质量较小的蛋白质的萃取影响见图。对不同相对分子质量的蛋白质，蛋白质的萃取影响见图。对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有增大加时，只有增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利完成，值的绝对值，相转移才能顺利完成，如如-糜蛋白酶糜蛋白酶(相对分子质量为相对分子质量为25000)的萃取率在的
30、萃取率在pH值低于值低于pI值值2-4时达到最高，而牛血清蛋白时达到最高，而牛血清蛋白(相对分子质量为相对分子质量为68000)在相同的系统中根本不发生相转移。这种差异性可在相同的系统中根本不发生相转移。这种差异性可解释为：对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸解释为：对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸第21页，本讲稿共29页远大于远大于“空核空核”的反胶束，萃取时势必要的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只能通过较强消耗较多的能量，这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调节的静电相互作用得到补偿。用调节pH的作的作用来增加蛋白质分子表面电荷的方法，正是达用来增加蛋白质分子表面电
31、荷的方法，正是达到增强静电作用的一条途径。对那些尺寸小于到增强静电作用的一条途径。对那些尺寸小于“空核空核”的反胶束中水体积的蛋白质，只要的反胶束中水体积的蛋白质，只要其所携带的净电荷与表面活性剂电性相反，其所携带的净电荷与表面活性剂电性相反，萃取就能发生。蛋白质的相对分子质量萃取就能发生。蛋白质的相对分子质量Mr与与(pH-pI)绝对值呈线性关系绝对值呈线性关系,见图见图,这种关系，这种关系，对阴离子及阳离子表面活性剂所形成的反胶束对阴离子及阳离子表面活性剂所形成的反胶束体系同样适用。体系同样适用。第22页，本讲稿共29页第23页，本讲稿共29页10.3.2 离子强度对萃取率的影响离子强度对
32、萃取率的影响离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的：所决定的：a.离子强度增大后，反胶束内表面的双电层变薄，离子强度增大后，反胶束内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度；的溶解度；b.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从而使蛋白质不能进入剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从而使蛋白质不能进入其中；其中；c.离子强度增加时，增大
33、了离子向反胶束内离子强度增加时，增大了离子向反胶束内“水池水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被盐析出来；被盐析出来；d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。如离子强变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。如离子强(KCl 浓浓度度)对萃取核糖酸酶对萃取核糖酸酶a,细胞色素细胞色素c和溶菌酶的影响见图和溶菌酶的影响见图,由图由图可见，在较低的可见，在较低的KCl浓度下，蛋白质几乎全部被萃取，当浓度下，蛋白质几乎全部被萃取，当KCl浓度高于一定值时
34、浓度高于一定值时,萃取率就开始下降，直至几乎为零。当萃取率就开始下降，直至几乎为零。当然，不同蛋白质开始下降时的然，不同蛋白质开始下降时的KCl浓度浓度第24页，本讲稿共29页是不同的。是不同的。第25页，本讲稿共29页10.3.3 表面活性剂类型的影响表面活性剂类型的影响:前面已经提到阴离子表面活前面已经提到阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可用于形性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可用于形成反胶束，关键是应从反胶束萃取蛋白质的机理出发，选成反胶束，关键是应从反胶束萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静用有利于增强蛋白质表面电荷
35、与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂，除此以外，还应电作用和增加反胶束大小的表面活性剂，除此以外，还应考虑形成反胶束及使反胶束变大考虑形成反胶束及使反胶束变大(由于蛋白质的进入由于蛋白质的进入)所需所需的能量的大小、反胶束内表面的电荷密度等因素，这些都的能量的大小、反胶束内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生影响。会对萃取产生影响。目前研究中常用的目前研究中常用的AOT反胶束体系和其他体系有许多反胶束体系和其他体系有许多不足，如不能用于分子量较大的蛋白质的萃取和往往在两不足，如不能用于分子量较大的蛋白质的萃取和往往在两相界面上形成不溶性的膜状物等等，为克服这些不足相界
36、面上形成不溶性的膜状物等等，为克服这些不足,可可通过在单一表面活性剂中加入具有亲和作用的生物表面活通过在单一表面活性剂中加入具有亲和作用的生物表面活性剂或另一种非离子型表面活性剂的方法来改善萃取性能。性剂或另一种非离子型表面活性剂的方法来改善萃取性能。第26页，本讲稿共29页10.3.4 表面活性剂浓度的影响表面活性剂浓度的影响增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。中形成比较
37、复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。因此，应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳因此，应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳浓度。浓度。总结反胶束体系对核糖核酸酶总结反胶束体系对核糖核酸酶a与伴刀豆球蛋白进行萃与伴刀豆球蛋白进行萃取的结果，得到了分配系数取的结果，得到了分配系数K同表面活性剂浓度同表面活性剂浓度S以及以及pH值的关系式：值的关系式：1nKA十十B*pH十十(C十十D*pH)lnS 式中系数式中系数A、B、C、D取决于蛋白质的性质，可通过实取决于蛋白质的性质，可通过实验测定。验测定。第27页，本讲稿共29页1035 离子种类对萃取的影响离子种类对萃取的影响阳
38、离子的种类对萃取率的影响主要体现在改变反胶束内表阳离子的种类对萃取率的影响主要体现在改变反胶束内表面的电荷密度上。通常反胶束中表面活性剂的极性基团不面的电荷密度上。通常反胶束中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上(相反离子缔合相反离子缔合)。极性基团的电离程度愈大，反胶束内表。极性基团的电离程度愈大，反胶束内表面的电荷密度愈大，产生的反胶束也愈大。面的电荷密度愈大，产生的反胶束也愈大。1036 影响反胶束结构的其他因素影响反胶束结构的其他因素1.有机溶剂的影响有机溶剂的影响:有机溶剂的种类影响反胶束的大小，从
39、而有机溶剂的种类影响反胶束的大小，从而影响水增溶的能力，所以可以利用因溶剂作用引起的不同胶影响水增溶的能力，所以可以利用因溶剂作用引起的不同胶束结构实现选择性增溶生物分子的目的，如束结构实现选择性增溶生物分子的目的，如-胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶随溶剂的不同在反胶束中增溶的比率会出现显著的差酶随溶剂的不同在反胶束中增溶的比率会出现显著的差别。别。第28页，本讲稿共29页 2.助表面活性剂的影响助表面活性剂的影响:当使用阳离子表面活性剂时，当使用阳离子表面活性剂时，引入助表面活性剂，能够增进有机相的溶解容量，这引入助表面活性剂，能够增进有机相的溶解容量，这多半是由于胶束尺寸增加而产生的。多半是由于胶束尺寸增加而产生的。3.温度的影响温度的影响:温度的变化对反胶束系统中的物理化温度的变化对反胶束系统中的物理化学性质有激烈的影响，增加温度能够增加蛋白质在有学性质有激烈的影响，增加温度能够增加蛋白质在有机相的溶解度，例如增加温度可使机相的溶解度，例如增加温度可使-胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶进入进入NH4-氯仿相并在转移率上分别增加氯仿相并在转移率上分别增加50。第29页，本讲稿共29页