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1、霍乱弧菌实验室检测技术霍乱弧菌实验室检测技术北京市海淀区北京市海淀区疾病预防控制中心疾病预防控制中心n霍乱的流行情况霍乱的流行情况n霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状n样本的采集样本的采集n检验操作程序检验操作程序n荧光定量荧光定量PCRPCR方法检测方法检测O1O1群、群、O139O139群群霍乱弧菌及霍乱毒素霍乱弧菌及霍乱毒素提纲提纲 由由O1O1群、群、O139O139群霍乱弧菌引起的群霍乱弧菌引起的霍霍乱以发病急、传播快、波及范围广、能引乱以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征，起大流行为特征，被世界卫生组织列为国被世界卫生组织列为国境卫生检疫传染病，也是我国传染病防治境卫生检
2、疫传染病，也是我国传染病防治法中规定强制管理的甲类传染病。法中规定强制管理的甲类传染病。O1群群霍乱霍乱弧菌弧菌的流行情况的流行情况1817年年1923年发生六次霍乱的世界大流行年发生六次霍乱的世界大流行均由均由O1群霍乱弧菌古典生物型引起群霍乱弧菌古典生物型引起1820年古典生物型引起的霍乱首次传到我国年古典生物型引起的霍乱首次传到我国1961年开始了第七次霍乱的世界大流行年开始了第七次霍乱的世界大流行均由均由O1群霍乱弧菌埃尔托生物型引起（群霍乱弧菌埃尔托生物型引起（1905年发现）年发现）1961年埃尔托生物型霍乱首次传到我国年埃尔托生物型霍乱首次传到我国O139群群霍乱霍乱弧菌弧菌的流
3、行情况的流行情况1992年印度马德拉斯发生年印度马德拉斯发生O139霍乱并迅速传霍乱并迅速传播播1993年年6月我国新疆发现月我国新疆发现O139霍乱流行。霍乱流行。1994年我市发现年我市发现O139霍乱疫情霍乱疫情O1群和群和O139群霍乱弧菌与其他霍乱弧群霍乱弧菌与其他霍乱弧菌的最大区别是能产生相同的霍乱毒素菌的最大区别是能产生相同的霍乱毒素n弧菌的分类弧菌的分类n形态与染色形态与染色n抗原结构、血清群抗原结构、血清群n生长与培养特性生长与培养特性n生化反应特性生化反应特性n对外界的抵抗力对外界的抵抗力n药物敏感性药物敏感性霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状n弧菌的分类（包括弧菌的分类（包
4、括5 5个属）个属）弧菌属弧菌属v霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等气单胞菌属气单胞菌属邻单胞菌属邻单胞菌属发光菌属发光菌属水栖菌属水栖菌属霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状n形态与染色形态与染色革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲呈弧形或逗点状单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲呈弧形或逗点状暗视野显微镜下，霍乱弧菌运动活泼，呈穿梭状或流星状暗视野显微镜下，霍乱弧菌运动活泼，呈穿梭状或流星状培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润霍乱的生
5、物学性状霍乱的生物学性状革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲成弧形或逗点状单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲成弧形或逗点状n抗原结构、血清群抗原结构、血清群H抗原和抗原和O抗原抗原根据根据O抗原不同，分为抗原不同，分为200多个血清型多个血清型根据根据O抗原成分的不同分抗原成分的不同分群特异性抗原因子群特异性抗原因子和和型特异性抗原因子型特异性抗原因子O1群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清型型v小川型含小川型含A、B抗原因子，也含少量抗原因子，也含少量C因子成分因子成分v稻叶型含
6、稻叶型含A、C因子因子v彦岛型含彦岛型含A、B、C因子因子霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状 n生长与培养特性生长与培养特性好氧同时兼性厌氧，最适生长温度好氧同时兼性厌氧，最适生长温度37钠离子可刺激生长钠离子可刺激生长耐碱不耐酸耐碱不耐酸初次分离时常用碱性蛋白胨水初次分离时常用碱性蛋白胨水(pH8.8-9.0)增菌培养，增菌培养，霍乱弧菌经霍乱弧菌经68h增菌后可在液体表面大量繁殖，形成菌膜增菌后可在液体表面大量繁殖，形成菌膜 霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状 n生化反应特性生化反应特性 两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、
7、麦芽糖 产酸不产气产酸不产气 迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖氧化酶试验氧化酶试验v弧菌属细菌大多为阳性弧菌属细菌大多为阳性粘丝实验粘丝实验v弧菌属细菌大多为阳性弧菌属细菌大多为阳性霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状 n对外界的抵抗力对外界的抵抗力在河、井、海水中可存活在河、井、海水中可存活13周以上周以上食物和海产品上存活食物和海产品上存活7天左右天左右对低温和碱耐受力强对低温和碱耐受力强（在食品上的弧菌于冰箱保存（在食品上的弧菌于冰箱保存（05度）比室温存活时间长）度）比室温存活时间长）对热、干燥、太阳直射敏感对热、干燥、太阳直射敏感对含氯制剂、碘制剂敏感对含氯制剂、
8、碘制剂敏感对酸和强氧化剂极敏感对酸和强氧化剂极敏感煮沸煮沸100度度12min即可被杀死即可被杀死n药物敏感性药物敏感性细菌带有可传递的耐药质粒细菌带有可传递的耐药质粒近年产生多重耐药株（丁胺卡那霉素近年产生多重耐药株（丁胺卡那霉素、强力霉素、复方新诺明强力霉素、复方新诺明）诺氟沙星和环丙沙星对霍乱弧菌保持较高的敏感性诺氟沙星和环丙沙星对霍乱弧菌保持较高的敏感性 霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状n霍乱的致病性霍乱的致病性主要毒素主要毒素v霍乱肠毒素霍乱肠毒素CTv小带联结毒素小带联结毒素zotv辅助霍乱肠毒素辅助霍乱肠毒素ace溶血素、溶细胞素、志贺样毒素溶血素、溶细胞素、志贺样毒素O139
9、群除具有上述群除具有上述 O1 群的致病物质外，还存在荚膜多糖和特殊群的致病物质外，还存在荚膜多糖和特殊 LPS 毒性决定簇，可抵抗血清中杀菌物质和黏附到小肠黏膜毒性决定簇，可抵抗血清中杀菌物质和黏附到小肠黏膜 上。上。霍乱的生物学性状霍乱的生物学性状 n腹泻患者样本采集腹泻患者样本采集水样便采水样便采13ml，成形便取指甲大小量成形便取指甲大小量肛拭子：生理盐水浸湿采便管由肛门插入直肠内肛拭子：生理盐水浸湿采便管由肛门插入直肠内35cm处旋转取出处旋转取出呕吐物采呕吐物采13ml标本和碱胨水比例为标本和碱胨水比例为1：5n水样及液体标本采集水样及液体标本采集采集相对静止表层水（采集相对静止表
10、层水（30cm内）内）500ml其他液体标本采集其他液体标本采集500ml23小时内送检小时内送检n涂抹样本采集涂抹样本采集23支无菌棉签涂抹支无菌棉签涂抹35只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔23支无菌棉签涂抹食品或物品表面（地沟口，下水管口，水池壁涂支无菌棉签涂抹食品或物品表面（地沟口，下水管口，水池壁涂抹，餐盘内外侧）抹，餐盘内外侧）直接放入直接放入10ml碱胨水送检碱胨水送检样本的采集样本的采集典型的米泔水样便典型的米泔水样便 n动力试验动力试验水样便：取一滴在玻片上，盖盖玻片，暗视野显微镜直接观察水样便：取一滴在玻片上，盖盖玻片，暗视野显微镜直接观察成形
11、便：取适量在生理盐水中研磨，盖盖玻片，镜下观察成形便：取适量在生理盐水中研磨，盖盖玻片，镜下观察高度可疑样本：取增菌的碱胨水在玻片上，盖盖玻片，镜下观察高度可疑样本：取增菌的碱胨水在玻片上，盖盖玻片，镜下观察镜下有穿梭样运动为动力试验阳性镜下有穿梭样运动为动力试验阳性n动力抑制试验动力抑制试验取取O1群、群、O139群霍乱弧菌诊断血清，取适量标本在其中研磨群霍乱弧菌诊断血清，取适量标本在其中研磨穿梭样运动消失，菌体凝集成块为动力抑制试验阳性穿梭样运动消失，菌体凝集成块为动力抑制试验阳性检验操作程序检验操作程序 n增菌及分离培养增菌及分离培养碱性蛋白胨水pH 8.8-9.0 注意标本和胨水的比例
12、要适当n分离培养基分两类分离培养基分两类选择性强的培养基v四号琼脂、TCBS、庆大培养基选择性弱的培养基v碱性琼脂和碱性胆盐琼脂检验操作程序检验操作程序霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）型霍乱弧菌在号平板型霍乱弧菌在号平板和上的菌落形态和上的菌落形态 病人病人粪粪便便标标本本增菌增菌 6-8h6-8h庆庆大平皿划大平皿划线线培养培养 18-24h18-24h每皿挑取每皿挑取9-109-10个可疑菌落血清凝集个可疑菌落血清凝集试验试验向医院属地向医院属地CDCCDC报报告告医学医学观观察病例察病
13、例霍乱分群霍乱分群诊诊断（断（单单克隆抗体）克隆抗体）群群群群 二次增菌6-8h1 1、悬滴动力试验（、悬滴动力试验（+），动力抑制试验），动力抑制试验（+）2 2、有明确流行病学史，动力试验（、有明确流行病学史，动力试验（+），），动力动力 抑制试验（抑制试验（+）症状典型但症状典型但服药患者便服药患者便检验操作程序检验操作程序 n菌株的初步鉴定菌株的初步鉴定血清凝集试验血清凝集试验n复核及鉴定复核及鉴定血清凝集试验血清凝集试验革兰氏染色革兰氏染色氧化酶试验氧化酶试验粘丝试验粘丝试验动力试验动力试验检验操作程序检验操作程序 n菌株的初步鉴定菌株的初步鉴定血清凝集试验血清凝集试验v挑取可疑菌落
14、与挑取可疑菌落与O1群、群、O139群霍乱弧菌诊断血群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验，很快出现均匀沙粒样凝集颗清做玻片凝集试验，很快出现均匀沙粒样凝集颗粒为阳性（一般不超过粒为阳性（一般不超过10s）v注意：菌液浑浊，似凝非凝不能判定为阳性注意：菌液浑浊，似凝非凝不能判定为阳性v同时做生理盐水对照同时做生理盐水对照v在在1min内不出现凝集为阴性内不出现凝集为阴性v结果可疑时需要做结果可疑时需要做PCR鉴定鉴定检验操作程序检验操作程序 n菌株的复核及分型菌株的复核及分型血清凝集试验血清凝集试验v用用O1群、群、O139群霍乱弧菌诊断血清与挑群霍乱弧菌诊断血清与挑取的菌落进行玻片凝集取的菌落进行
15、玻片凝集vO1群霍乱弧菌分型用小川型和稻叶型单价群霍乱弧菌分型用小川型和稻叶型单价血清进行玻片凝集血清进行玻片凝集v结果分结果分3种情况种情况v同时做生理盐水对照同时做生理盐水对照检验操作程序检验操作程序 n菌株的复核及分型菌株的复核及分型氧化酶试验氧化酶试验v弧菌属大部分为阳性，作为弧菌的简易辅助鉴定方法弧菌属大部分为阳性，作为弧菌的简易辅助鉴定方法v用氧化酶试剂（用氧化酶试剂（1%盐酸二甲基对苯二胺）湿润滤纸盐酸二甲基对苯二胺）湿润滤纸v取营养琼脂上菌落涂抹于有试剂的滤纸上取营养琼脂上菌落涂抹于有试剂的滤纸上v反应部位在反应部位在12min内出现粉红内出现粉红-紫红紫红-紫蓝色判为阳性紫蓝
16、色判为阳性v肠杆菌科细菌不变色或变粉后很快退色肠杆菌科细菌不变色或变粉后很快退色v注意不使用过期试剂和金属接种针注意不使用过期试剂和金属接种针检验操作程序检验操作程序 n菌株的复核及分型菌株的复核及分型粘丝试验粘丝试验v弧菌属大部分为阳性作为弧菌的简易辅助鉴定方法弧菌属大部分为阳性作为弧菌的简易辅助鉴定方法v在玻璃平皿上滴一大滴在玻璃平皿上滴一大滴0.5%去氧胆酸钠溶液去氧胆酸钠溶液v取营养琼脂上新鲜培养物研磨后与试剂研磨混合取营养琼脂上新鲜培养物研磨后与试剂研磨混合v混悬液变清亮粘稠，可拉出细长丝者为阳性混悬液变清亮粘稠，可拉出细长丝者为阳性v阴性者呈均匀悬液状态阴性者呈均匀悬液状态动力试验
17、动力试验革兰氏染色革兰氏染色检验操作程序检验操作程序 n药敏试验药敏试验根根据据美美国国临临床床实实验验室室标标准准委委员员会会（NCCLSNCCLS）推推荐荐的的Kirby-BauerKirby-Bauer（K-BK-B）氏法氏法进进行。行。检验操作程序检验操作程序菌种接种营养琼脂371618h 菌落接种营养肉汤3746h 调整菌液到0.5麦氏单位MH培养基上涂布菌液贴药敏纸片游标卡尺测量抑菌圈直径 371824h n药敏试验注意事项药敏试验注意事项每次药敏试验每次药敏试验必必须须用用ATCC 25922ATCC 25922大大肠肠杆菌做杆菌做质质控控使用的使用的MH培养基不能太薄培养基不能
18、太薄使用的使用的MH培养基培养基PHPH值应为值应为7.37.3抑菌抑菌环环的的边缘边缘以肉眼以肉眼见见不到不到细细菌明菌明显显生生长为长为限限 不可用过期的试剂和药敏纸片不可用过期的试剂和药敏纸片检验操作程序检验操作程序 n荧光定量荧光定量PCRPCR方法鉴定方法鉴定探针和引物探针和引物检验操作程序检验操作程序SO1FGACTCACCTTCGATTTCAGCAASO1RGAATAACTCAAGGCGATGAAGTGATO1 probeFACGGGTAACGCACCACACTGGACTATGPSO139FGCGGTGTAGCGGGTTTTATTAGSO139RTGCATAATACTTTCGAC
19、CATGGAO139 probeFAAACAGTCGACCGGCGATAAACGCTPSCTXFTTTCATCGCAAGTATTACTCATCGASCTXRAAGAGCCGTGGATTCATCATGCT probeFAGCATTCCCACAACCCGGCGP n荧光定量荧光定量PCRPCR方法鉴定方法鉴定模板的制备：模板的制备：挑取数个菌落加入装有挑取数个菌落加入装有100去离子水的去离子水的1.5mL 管中管中,混匀后混匀后100 10分钟，分钟，12000转转/分钟离心分钟离心5分钟，取上清液作为模板。分钟，取上清液作为模板。检验操作程序检验操作程序 n荧光定量荧光定量PCRPCR方法鉴定
20、方法鉴定反应体系的配制反应体系的配制(20 体系体系)（Pemix Ex TaqTM TaKaRa 生物公司提供）生物公司提供）2 PCR反应混合物：反应混合物：10/份份 上游上游引物（引物（10M）：）：0.4/份份 下游下游引物（引物（10M）：）：0.4/份份 探针（探针（10mol/）：）：0.4/份份 模板模板DNA：2/份份 DDw：6.8/份份 Total:20 检验操作程序检验操作程序 n荧光定量荧光定量PCRPCR方法鉴定方法鉴定荧光定量荧光定量PCRPCR反应条件反应条件：95 10s 95 10s 95 5s 95 5s 60 20s 60 20s 结果判定：结果判定：CtCt值在值在10-3010-30之间且有典型的之间且有典型的“S”S”形曲线形曲线检验操作程序检验操作程序4040cyclescycles