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1、专题二 微生物的培育与应用课题一 微生物的试验室培育培育基：人们依据微生物对养分物质的不同需求，配 制出供其生长生殖的养分基质，是进展微生物培育的物质根底。培育基依据物理性质可分为液体培育基 半固体培育基和固体培育基。在液体培育基中参加凝固剂琼脂是从红藻中提取的一种多糖，在配制培育基中用作凝固剂 后，制成琼脂固体培育基。微生物在固体培育基外表生长，可以形成肉眼可见的菌落。依据菌落的特征可以推断是哪一种菌。 液体培育基应用于工业或生活生产， 固体培育基应用于微生物的分别和鉴定， 半固体培育基则常用于观看微生物的运动及菌种保藏等。依据成分培育基可分为人工合成培育基和自然培育基。合成培育基是用成分的
2、化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分别鉴定。 自然培育基是用化学成分不明的自然物质配制而成，常用于实际工业生产。依据培育基的用途，可将培育基分为选择培育基和鉴定培育基。选择培育基是指在培育基中参加某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培育基是依据微生物的特点，在培育基中参加某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。培育基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。碳源：能为微生物的代谢供给碳元素的物质。如 CO 、NaHCO 等无机碳源；糖类、23石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单
3、质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢供给氮元素的物质。如 N 、NH 、NO -、NH +无机氮源23342023 年9 月蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨有机氮源等。 只有固氮微生物才能利用 N 。2培育基还要满足微生物生长对 pH、特别养分物质以及氧气的要求。例如，培育乳酸杆菌时需要在培育基中添加维生素，培育霉菌时须将培育基的 pH 调至酸性，培育细菌是需要将pH 调至中性或微碱性，培育厌氧型微生物是则需要供给无氧的条件无菌技术获得纯洁培育物的关键是防止外来杂菌的入侵，要留意以下几个方面：对试验操作的空间、操作者的衣着和手，进展清洁和消毒。将用于微生物培育的器皿、接种用具和培育基等
4、器具进展灭菌。为避开四周环境中微生物的污染，试验操作应在酒精灯火焰四周进展。试验操作时应避开已经灭菌处理的材料用具与四周的物品相接触。无菌技术除了用来防止试验室的培育物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避开操作者自身被微生物感染。消毒与灭菌的区分消毒指使用较为温存的物理或化学方法仅杀死物体外表或内部一局部对人体有害的微生物不包括芽孢和孢子。消毒方法常用 煮沸消毒法，巴氏消毒法对于一些不耐高温的液体还有化学药剂如酒精、氯气、石炭酸等消毒、紫外线消毒。灭菌则是指使用猛烈的理化因素杀死物体内外全部的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法：
5、接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；2023 年9 月培育基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。外表灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。比较理化因素的作消灭微生物的数芽孢和孢子能否项用强度量被消灭消毒较为温存局部生活状态的微生物不能灭菌猛烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白胨固体培育基（1） 方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2） 倒平板操作的步骤：将灭过菌的培育皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培育基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，将瓶口快速通过火焰。用左手的拇指和食指将培育皿翻开一
6、条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培育基约 1020mL倒入培育皿，左手马上盖上培育皿的皿盖。等待平板冷却凝固，大约需 510min。然后，将平板倒过来放置，使培育皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的争辩1. 培育基灭菌后，需要冷却到 50左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来估量培育基的温度？提示：可以用手触摸盛有培育基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进展倒平板了。2. 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培育基。3. 平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会分散水珠，凝固后的培育基外表的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使
7、培育基外表的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培育基，造成污染。4. 在倒平板的过程中，假设不留神将培育基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培育微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培育基上滋生，因此最好不要用这个平板培育微生物。纯化大肠杆菌（1） 微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2） 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培育基外表连续划线的操作。将聚拢的菌种逐步稀释分散到培育基的外表。在数次划线后培育，可以分别到由一个细胞生殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3） 稀释涂布平板法是将菌液进展一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌
8、液分别涂布到琼脂固体培育基的外表，进展培育。分为系列 稀释操作和涂布平板操作两步。（4） 用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚拢在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培育基外表形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5） 平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并翻开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖翻开一条缝隙 ，右手将沾有菌种的接种环快速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。留意不要划破培育皿。 灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开头往其次区域内划线。重复以上操作，在
9、三、四、五区域内划线。留意不要将最终一区的划线与第一区相连。 将平板倒置放入培育箱中培育。平板划线操作的争辩1. 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作完毕时， 仍旧需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避开接种环上可能存在的微生物污染培育物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线完毕后，接种环上残留的菌种，使下一 次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加， 使每次划线时菌种的数目渐渐削减，以便得到菌落。划线完毕后灼烧接种环，能及 时杀死接种环上残留的菌种，避开细菌污染环境和感染操作者。2. 在灼烧接种环之后，为什么要
10、等其冷却后再进展划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3. 在作其次次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开头划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开头，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步削减，最终能得到由单个细菌生殖而来的菌落。（6） 涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培育基外表。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在培育基外表。涂布平板操作的争辩涂布平板的全部操作都应在火焰四周进展。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第 2 步应如何进
11、展无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培育皿的距离要适宜、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰四周；等等。菌种的保存（1） 对于频繁使用的菌种，可以承受临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培育基上，在适宜的温度下培育。当菌落长成后， 将试管放入 4的冰箱中保藏。以后每 36 个月，都要重将菌种从旧的培育基上转移到颖的培育基上。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种简洁被污染或产生变异。（2） 对于需要长期保存的菌种，可以承受甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培育的菌液转移到甘油瓶中， 与甘油充分混匀后
12、，放在20的冷冻箱中保存。疑难解答（1） 生物的养分养分是指生物摄取、利用养分物质的过程。养分物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。人及动物的养分物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的养分物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的养分物质：水、无机盐、碳源、氮源及特别养分物质五类。（2） 确定培育基制作是否合格的方法将未接种的培育基在恒温箱中保温 12 天，无菌落生长，说明培育基的制备是成功的，否则需要重制备。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分别与计数尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸取。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。
13、土壤中的细菌之所以能分解尿素，是由于他们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中觉察的筛选菌株（1） 试验室中微生物的筛选应用的原理人为供给有利于目的菌株生长的条件包括养分、温度、pH 等，同时抑制或阻挡其他微生物生长。（2） 选择性培育基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻挡其他种类微生物生长的培育基，称作选择培育基。（3） 配制选择培育基的依据依据选择培育的菌种的生理代谢特点参加某种物质以到达选择的目的。例如，培育基中不参加有机物可以选择培育自养微生物；培育基中不参加氮元素，可以选择培育能固氮的微生物；参加高浓度的食盐可选择培育金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1） 测定微生物数
14、量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2） 稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培育基外表生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推想出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置 35 个平板，选择菌落数在 30300 的平板进展计数， 并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。承受此方法的留意事项：1.一般选取菌落数在 30300 之间的平板进展计数 2.为了防止菌落集中，影响计数，可在培育基中参加TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物设置比照设置比照的主要目
15、的是排解试验组中非测试因素对试验结果的影响，提高试验结果的可信度。比照试验是指除了被测试的条件以外，其他条件都一样的试验，其作用是比照试验组，排解任何其他可能缘由的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。试验设计试验设计包括试验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以准时间安排等的综合考虑和安排。（1） 土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7 的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约 38cm 的土壤层取样。适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用 104105106测定放线菌的数
16、量，一般选用 103104105测定真菌的数量，一般选用 102103104（2） 样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用肯定稀释范围的样品液进展培育，以保证获得菌落数在 30 到 300 之间、（3） 微生物的培育与观看不同种类的微生物，往往需要不同的培育温度和培育时间。细菌3037 12 天放线菌 2528 57 天 霉菌 2528 34 天每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培育时间缺乏而导致一楼菌落的数目。一般来说，在肯定的培育条件下一样的培育基、唯独及培育时间，同种微生物表现出稳定的菌落特征。外形
17、、大小、隆起程度、颜色。疑难解答1如何从平板上的菌落数推想出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3 个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=C/V*M 其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积ml，M 代表稀释倍数课题三 分解纤维素的微生物的分别纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素与纤维素酶（1） 棉花是自然界中纤维素含量最高的自然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2） 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C 酶、C 酶和葡萄1X糖苷酶，前两
18、种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长供给养分。纤维素分解菌的筛选（1） 筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反响直接对微生物进展筛选。（2） 刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反响。当我们在含有纤维素的培育基中参加刚果红时，刚果红能与培育基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培育基中会消灭以纤维素分解菌为中心的透亮圈。这样，我们就可以通过是否产生透亮圈来筛选纤维素分解菌。分别分解纤
19、维素的微生物的试验流程土壤取样选择培育此步是否需要，应依据样品中目的菌株数量的多少来确定梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培育基上选择产生透亮圈的菌落（1） 土壤采集 选择富含纤维素的环境。（2） 刚果红染色法分别纤维素分解菌的步骤倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3） 刚果红染色法种类一种是先培育微生物，再参加刚果红进展颜色反响，另一种是在倒平板时就参加刚果红。课题延长对分解纤维素的微生物进展了初步的筛选后，只是分别纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进展发酵产纤维素酶的试验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所
20、产生的葡萄糖进展定量的测定。疑难解答（1） 为什么要在富含纤维素的环境中查找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于一般环境。（2） 将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应当埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚拢，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约 10cm 左右腐殖土壤中。（3） 两种刚果红染色法的比较方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，参加刚果红溶液会使菌落之间发生混杂； 其优点是这样显示出的颜色反响根本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操 作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类 物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物消灭假阳性反响。但这种只产生淀粉酶的微 生物产生的透亮圈较为模糊，由于培育基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素 酶产生的透亮圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的力量， 它们在长时间培育过程中会降解刚果红形成明显的透亮圈，与纤维素分解菌不易区 分。（4） 为什么选择培育能够“浓缩”所需的微生物？在选择培育的条件下，可以使那些能够适应这种养分条件的微生物得到快速生殖，而那些不适应这种养分条件的微生物的生殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。