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1、专题二 微生物的培育与应用课题一 微生物的试验室培育培育基：人们根据微生物对养分物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的养分基质，是进展微生物培育的物质根底。培育基根据物理性质可分为液体培育基 半固体培育基与固体培育基。在液体培育基中参加凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培育基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培育基。微生物在固体培育基外表生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以推断是哪一种菌。液体培育基应用于工业或生活消费，固体培育基应用于微生物的分别与鉴定，半固体培育基则常用于视察微生物的运动及菌种保藏等。根据成分培育基可分为人工合成培育基与自然培育基。合成培育基是用成分已知的化
2、学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分别鉴定。自然培育基是用化学成分不明的自然物质配制而成，常用于实际工业消费。根据培育基的用处，可将培育基分为选择培育基与鉴定培育基。选择培育基是指在培育基中参加某种化学物质，以抑制不须要的微生物生长，促进所须要的微生物的生长。鉴别培育基是根据微生物的特点，在培育基中参加某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。培育基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。碳源：能为微生物的代谢供应碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作
3、为碳源。氮源：能为微生物的代谢供应氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。培育基还要满意微生物生长对pH、特别养分物质以及氧气的要求。例如，培育乳酸杆菌时须要在培育基中添加维生素，培育霉菌时须将培育基的pH调至酸性，培育细菌是须要将pH调至中性或微碱性，培育厌氧型微生物是则须要供应无氧的条件无菌技术获得纯洁培育物的关键是防止外来杂菌的入侵，要留意以下几个方面：对试验操作的空间、操作者的穿着与手，进展清洁与消毒。将用于微生物培育的器皿、接种用具与培育基等器具进展灭菌。为避开四周环境中微生物的污染，
4、试验操作应在酒精灯火焰旁边进展。试验操作时应避开已经灭菌处理的材料用具与四周的物品相接触。无菌技术除了用来防止试验室的培育物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避开操作者自身被微生物感染。消毒与灭菌的区分消毒指运用较为温与的物理或化学方法仅杀死物体外表或内部一局部对人体有害的微生物（不包括芽孢与孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。灭菌则是指运用剧烈的理化因素杀死物体内外全部的微生物，包括芽孢与孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法：接种环、接种针、试管口等运用灼烧灭
5、菌法；玻璃器皿、金属用具等运用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； 培育基、无菌水等运用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。外表灭菌与空气灭菌等运用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。比拟项理化因素的作用强度歼灭微生物的数量芽孢与孢子能否被歼灭消毒较为温与局部生活状态的微生物不能灭菌剧烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白胨固体培育基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2）倒平板操作的步骤：将灭过菌的培育皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培育基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，将瓶口快速通过火焰。用左手的拇指与食指将培育皿翻开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培育基（约1020
6、mL）倒入培育皿，左手马上盖上培育皿的皿盖。等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板倒过来放置，使培育皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的探讨1.培育基灭菌后，须要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来估计培育基的温度？提示：可以用手触摸盛有培育基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进展倒平板了。2.为什么须要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培育基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝聚水珠，凝固后的培育基外表的湿度也比拟高，将平板倒置，既可以使培育基外表的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培育基，
7、造成污染。4.在倒平板的过程中，假如不当心将培育基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培育微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培育基上滋生，因此最好不要用这个平板培育微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法与稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培育基外表连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培育基的外表。在数次划线后培育，可以分别到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将菌液进展一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培育基的外表，进展培育。分为系列稀释操作与涂布平板
8、操作两步。（4）用平板划线法与稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培育基外表形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并翻开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖翻开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环快速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。留意不要划破培育皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开场往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。留意不要将最终一区的划线与第一区相连。将平板倒置放入培育箱
9、中培育。平板划线操作的探讨1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作完毕时，仍旧须要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避开接种环上可能存在的微生物污染培育物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线完毕后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种干脆来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目渐渐削减，以便得到菌落。划线完毕后灼烧接种环，能刚好杀死接种环上残留的菌种，避开细菌污染环境与感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进展划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为
10、什么总是从上一次划线的末端开场划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开场，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步削减，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培育基外表。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用涂布器将菌液匀称地涂布在培育基外表。涂布平板操作的探讨涂布平板的全部操作都应在火焰旁边进展。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进展无菌操作？提示：应从操作的各个细微环节保证“无菌”。例如，酒精灯与培育皿的间隔 要适宜、吸管头不要接触
11、任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰四周；等等。菌种的保存（1）对于频繁运用的菌种，可以采纳临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培育基上，在适宜的温度下培育。当菌落长成后，将试管放入4的冰箱中保藏。以后每36个月，都要重新将菌种从旧的培育基上转移到簇新的培育基上。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种简单被污染或产生变异。（2）对于须要长期保存的菌种，可以采纳甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培育的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在20的冷冻箱中保存。疑难解答（1）生物的养分养分是指生物摄取、利用养分物质的过程。养分物质是指维持机体生命活动，保
12、证发育、生殖所需的外源物质。人及动物的养分物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的养分物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的养分物质：水、无机盐、碳源、氮源及特别养分物质五类。（2）确定培育基制作是否合格的方法将未接种的培育基在恒温箱中保温12天，无菌落生长，说明培育基的制备是胜利的，否则须要重新制备。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分别与计数尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能干脆被农作物汲取。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中发觉的挑选菌株（1）试验室中微生物的挑选应用的原理人
13、为供应有利于目的菌株生长的条件（包括养分、温度、pH等），同时抑制或阻挡其他微生物生长。（2）选择性培育基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻挡其他种类微生物生长的培育基，称作选择培育基。（3）配制选择培育基的根据根据选择培育的菌种的生理代谢特点参加某种物质以到达选择的目的。例如，培育基中不参加有机物可以选择培育自养微生物；培育基中不参加氮元素，可以选择培育能固氮的微生物；参加高浓度的食盐可选择培育金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法与显微镜干脆计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培育基外表生长的
14、一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推想出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果精确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进展计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采纳此方法的留意事项：1.一般选取菌落数在30300之间的平板进展计数2.为了防止菌落扩散，影响计数，可在培育基中参加TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物设置比照设置比照的主要目的是解除试验组中非测试因素对试验结果的影响，进步试验结果的可信度。比照试验是指除了被测试的条件以外，其他条件都一样的试验，其作用是比照试验组，解除任何
15、其他可能缘由的干扰，证明的确是所测试的条件引起相应的结果。试验设计试验设计包括试验方案，所需仪器、材料、用具与药品，详细的施行步骤以刚好间支配等的综合考虑与支配。（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约38cm的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将干脆影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用肯定稀释范围的样品液进展培育，以保证获得菌落数在30到300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106测定放线菌的数量，
16、一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104（3）微生物的培育与视察不同种类的微生物，往往须要不同的培育温度与培育时间。细菌3037 12天放线菌2528 57天 霉菌2528 34天每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培育时间缺乏而导致一楼菌落的数目。一般来说，在肯定的培育条件下（一样的培育基、唯独及培育时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形态、大小、隆起程度、颜色。疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推想出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的
17、菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数课题三 分解纤维素的微生物的分别纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素与纤维素酶（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的自然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶与葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长供应养分。纤维素分解菌的挑选（1）挑选方法：刚果红染色法。可以通过颜色反响干
18、脆对微生物进展挑选。（2）刚果红染色法挑选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖与葡萄糖发生这种反响。当我们在含有纤维素的培育基中参加刚果红时，刚果红能与培育基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培育基中会出现以纤维素分解菌为中心的透亮圈。这样，我们就可以通过是否产生透亮圈来挑选纤维素分解菌。分别分解纤维素的微生物的试验流程土壤取样选择培育（此步是否须要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培育基上选择产生透亮圈的菌落（1）土壤采集 选择富
19、含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分别纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类一种是先培育微生物，再参加刚果红进展颜色反响，另一种是在倒平板时就参加刚果红。课题延长对分解纤维素的微生物进展了初步的挑选后，只是分别纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还须要进展发酵产纤维素酶的试验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵与固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进展定量的测定。疑难解答（1）为什么要在富含纤维素的环境中找寻纤维素分解菌？由于生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对进步，因此从这种土
20、样中获得目的微生物的几率要高于一般环境。（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应当埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，事实上是人工设置纤维素分解菌生存的相宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。（3）两种刚果红染色法的比拟方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，参加刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反响根本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素与琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使可以产生淀粉酶的微生物出现假阳性反响。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透亮圈较为模糊，因为培育基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透亮圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的实力，它们在长时间培育过程中会降解刚果红形成明显的透亮圈，与纤维素分解菌不易区分。（4）为什么选择培育可以“浓缩”所需的微生物？在选择培育的条件下，可以使那些可以适应这种养分条件的微生物得到快速繁殖，而那些不适应这种养分条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。