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1、专题 和蛋质技术专题整合第1页，本讲稿共17页第2页，本讲稿共17页提取提取DNA利用的是利用的是DNA、RNA、蛋白、蛋白质质和脂和脂质质的理化性的理化性质质的差异。的差异。具体地具体地说说，DNA与其他物与其他物质质在不同在不同浓浓度的度的NaCl溶液中溶解度不同，溶液中溶解度不同，再通再通过过冷酒精冷酒精进进一步去除其他一步去除其他杂质杂质。另外。另外DNA对对高温和洗高温和洗涤剂涤剂的的耐受性耐受性较较高，不易被破坏。高，不易被破坏。鉴鉴定定时时可采用二苯胺可采用二苯胺试剂试剂沸水浴加沸水浴加热热呈呈蓝蓝色来判断色来判断DNA的存在。的存在。DNA与蛋白质的提取与蛋白质的提取 第3页，
2、本讲稿共17页提提取取与与分分离离蛋蛋白白质质是是根根据据蛋蛋白白质质的的分分子子形形状状和和大大小小，所所带带电电荷荷的的性性质质和和多多少少，溶溶解解度度、吸吸附附性性质质以以及及对对其其他他分分子子的的亲亲和和力力等等理理化化性性质质，将将不不同同种种类类的的蛋蛋白白质质分分离离开开。凝凝胶胶色色谱谱法法可可以以将将相相对对分分子子质质量量不不同同的蛋白的蛋白质质有效分离。有效分离。DNA与蛋白与蛋白质质的提取技的提取技术术比比较较电电泳法可将泳法可将带带有不同有不同电电荷的蛋白荷的蛋白质质分离。分离。DNA血血红红蛋白蛋白材料材料选选取取鸡鸡血血细细胞等胞等DNA含量相含量相对较对较高
3、的高的生物生物组织组织哺乳哺乳动动物的成熟物的成熟红细红细胞胞细细胞胞破碎破碎加蒸加蒸馏馏水、加洗水、加洗涤剂涤剂和食和食盐搅盐搅拌、拌、研磨研磨加蒸加蒸馏馏水和甲苯充分水和甲苯充分搅搅拌拌第4页，本讲稿共17页去除去除杂质杂质用不同用不同浓浓度的度的NaCl溶液溶液处处理理用酒精溶液用酒精溶液处处理理用蛋白酶处理用蛋白酶处理透析透析处处理理纯纯化化处处理理鉴鉴定定加入二苯胺，沸水浴加入二苯胺，沸水浴SDS聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳法泳法测测定蛋白定蛋白质质的相的相对对分分子子质质量量第5页，本讲稿共17页PCR技术与凝胶色谱法的比较技术与凝胶色谱法的比较 PCR凝胶色凝胶色谱谱法法过
4、过程程变变性：性：90 以上高温解旋以上高温解旋复性：复性：50 左右引物与单链结左右引物与单链结合合延伸：延伸：72 合成子链合成子链凝胶色凝胶色谱谱柱的制作柱的制作装填：凝胶装填均匀，无气泡装填：凝胶装填均匀，无气泡纯化纯化酶酶需要需要热稳热稳定性高的定性高的TaqDNA聚合聚合酶酶不需要不需要酶酶温度温度高温高温常温常温第6页，本讲稿共17页DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较及原理比较 第7页，本讲稿共17页试剂试剂质质量量浓浓度度用途用途原理原理NaCl溶液溶液2 mol/L溶解溶解DNADNA在在NaCl溶液中的溶解度随溶液溶液中的溶解度随溶液浓
5、浓度的度的变变化而改化而改变变，溶解度在，溶解度在质质量量浓浓度度为为2 mol/L时时最最大、在大、在质质量量浓浓度度为为0.14 mol/L时时最小最小0.14mol/L析出析出DNA2 mol/L鉴鉴定定时时的溶的溶剂剂酒精酒精95%(体体积积分数分数)除去除去杂杂质质以提以提纯纯DNADNA不溶于酒精，但是不溶于酒精，但是细细胞中的某些物胞中的某些物质则质则可以溶于酒精可以溶于酒精二苯二苯胺胺/鉴鉴定定剂剂DNA遇二苯胺遇二苯胺(沸水浴沸水浴)会会变蓝变蓝色色柠柠檬檬酸酸钠钠0.03 g/mL抗凝抗凝剂剂除去血液中的除去血液中的钙钙离子，防止血液凝固离子，防止血液凝固第8页，本讲稿共1
6、7页【典例【典例1】下下表是关于表是关于DNA粗提取与粗提取与鉴鉴定定实验实验中所使用的材料、中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是操作及其作用的表述，正确的是()。试剂试剂操作操作作用作用A柠柠檬酸檬酸钠钠与与鸡鸡血混合血混合溶解溶解细细胞胞中中DNAB蒸蒸馏馏水水与与鸡鸡血血细细胞混合胞混合保持保持细细胞形状胞形状C蒸蒸馏馏水水加入到溶解有加入到溶解有DNA的的NaCl溶液中溶液中析出析出DNA丝丝状物状物D冷却的酒精冷却的酒精加入到加入到过滤过滤后含后含DNA的的NaCl溶液中溶液中产产生特定生特定的的颜颜色反色反应应第9页，本讲稿共17页解解析析在在DNA的的粗粗提提取取与与鉴鉴
7、定定实实验验中中，柠柠檬檬酸酸钠钠可可以以防防止止血血液液凝凝固固；鸡鸡血血中中加加入入蒸蒸馏馏水水可可以以使使细细胞胞膜膜和和核核膜膜破破裂裂；DNA在在不不同同浓浓度度的的NaCl溶溶液液中中溶溶解解度度不不同同，在在质质量量浓浓度度为为0.14 mol/L NaCl溶溶液液中中溶溶解解度度最最低低，有有利利于于DNA析析出出；DNA不不溶溶于于酒酒精精，可可以以获获得得较较纯的纯的DNA；DNA遇二苯胺遇二苯胺(水浴加热水浴加热)产生蓝色反应产生蓝色反应。答案答案C第10页，本讲稿共17页(1)为为避避免免外外源源DNA等等因因素素的的污污染染，PCR实实验验中中使使用用的的微微量量离离
8、心心管管、枪头枪头、缓缓冲液以及蒸冲液以及蒸馏馏水等在使用前必水等在使用前必须进须进行高行高压灭压灭菌。菌。(2)在在微微量量离离心心管管中中添添加加反反应应成成分分时时，每每吸吸取取一一种种试试剂剂后后，移移液液器器上的上的枪头枪头必必须须更更换换。(3)所所有有的的成成分分都都加加入入后后，盖盖严严离离心心管管的的盖盖子子，用用手手指指轻轻轻轻弹弹击击管管的的侧侧壁，混匀后离心壁，混匀后离心处处理，使反理，使反应应液集中在离心管底部。液集中在离心管底部。PCR技术操作注意事项技术操作注意事项 第11页，本讲稿共17页(4)PCR实实验验中中应应注注意意各各种种反反应应成成分分的的用用量量，
9、用用量量不不当当、漏漏加加成成分分、PCR程序程序设设置不当等，均有可能置不当等，均有可能导导致致DNA片段片段扩扩增的失增的失败败。(5)PCR扩扩增增的的是是位位于于两两种种引引物物之之间间的的DNA片片段段，合合理理设设计计引引物物是是PCR成功的关成功的关键键。第12页，本讲稿共17页【典典例例2】PCR实实验验中中使使用用的的微微量量离离心心管管、缓缓冲冲溶溶液液以以及及蒸蒸馏馏水水使使用前必用前必须进须进行的关行的关键键步步骤骤是是()。A反复洗反复洗涤涤 B用酒精擦洗用酒精擦洗C高高压灭压灭菌菌 D在在20 储储存存解解析析为为了了避避免免外外源源DNA等等因因素素的的污污染染，
10、PCR实实验验中中使使用用的的微微量量离离心心管管、枪枪头头、缓缓冲冲液液以以及及蒸蒸馏馏水水等等在在使使用用前前必必须须进进行行高高压压灭灭菌菌。PCR所所用用的的缓缓冲冲液液和和酶酶应应分分装装成成小小份份，并并在在20 储储存存。使使用用前前，将将所所需需的的试试剂剂从从冰冰箱箱内内拿拿出出，放放在在冰冰块块上上缓缓慢慢融化。融化。答案答案C 第13页，本讲稿共17页【例例1】(2011广广东东理理综综，5)下下列列关关于于猪猪血血红红蛋蛋白白提提纯纯的的描描述述，不不正确的是正确的是()。A洗洗涤红细涤红细胞胞时时，使用生理，使用生理盐盐水可防止水可防止红细红细胞破裂胞破裂B猪成熟猪成
11、熟红细红细胞中缺少胞中缺少细细胞器和胞器和细细胞核，提胞核，提纯时杂纯时杂蛋白蛋白较较少少C血血红红蛋白的蛋白的颜颜色可用于凝胶色色可用于凝胶色谱谱法分离法分离过过程的程的监测监测D在在凝凝胶胶色色谱谱法法分分离离过过程程中中，血血红红蛋蛋白白比比分分子子量量较较小小的的杂杂蛋蛋白移白移动动慢慢第14页，本讲稿共17页解解析析猪猪成成熟熟红红细细胞胞中中缺缺少少细细胞胞器器和和细细胞胞核核，提提纯纯时时杂杂蛋蛋白白较较少少，是是提提纯纯血血红红蛋蛋白白的的理理想想材材料料。提提纯纯血血红红蛋蛋白白分分四四步步：红红细细胞胞的的洗洗涤涤、血血红红蛋蛋白白的的释释放放、分分离离血血红红蛋蛋白白溶溶
12、液液、透透析析，其其中中洗洗涤涤红红细细胞胞时时，要要用用生生理理盐盐水水反反复复洗洗涤涤，既既要要将将红红细细胞胞洗洗涤涤干干净净，又又要要不不破破坏坏红红细细胞胞，然然后后再再用用蒸蒸馏馏水水和和甲甲苯苯使使红红细细胞胞破破裂裂，释释放放出出血血红红蛋蛋白白。分分离离提提纯纯血血红红蛋蛋白白时时用用凝凝胶胶色色谱谱法法，是是根根据据相相对对分分子子质质量量的的大大小小来来分分离离蛋蛋白白质质，相相对对分分子子质质量量大大的的蛋蛋白白质质移移动动速速度度较较快快；血血红红蛋蛋白白的的颜颜色色可可用用于于观观察察红红色色区区带带的的移移动动情情况况，并并据据此此判判断断分分离效果。故离效果。故
13、D不正确。不正确。答案答案D第15页，本讲稿共17页【例【例2】(江苏高考江苏高考)下下列叙述中列叙述中错误错误的是的是()。A改改变变NaCl溶液的溶液的浓浓度只能使度只能使DNA溶解而不能使其析出溶解而不能使其析出B在沸水浴中，在沸水浴中，DNA遇二苯胺遇二苯胺试剂试剂会呈会呈现蓝现蓝色色C用用电电泳法可分离泳法可分离带电带电性性质质、分子大小和形状不同的蛋白、分子大小和形状不同的蛋白质质D用透析法可去除蛋白用透析法可去除蛋白质样质样品中的小分子物品中的小分子物质质解解析析提提取取DNA的的原原理理，是是DNA在在不不同同浓浓度度NaCl溶溶液液中中的的溶溶解解度度不不同同。DNA在在质质
14、量量浓浓度度为为0.14 mol/L的的NaCl溶溶液液中中溶溶解解度度最最小小，因因此此如如果果将将NaCl浓浓度度调调至至质质量量浓浓度度为为0.14 mol/L会会使使DNA溶解度变小而呈析出状态。溶解度变小而呈析出状态。答案答案A第16页，本讲稿共17页考情分析：考情分析：本专题内容包括本专题内容包括DNA粗提取与鉴定、多聚酶链式反应粗提取与鉴定、多聚酶链式反应扩增扩增DNA、血红蛋白的提取与分离等，高考对本专题内容的考查、血红蛋白的提取与分离等，高考对本专题内容的考查多集中于多集中于DNA粗提取原理、粗提取原理、DNA鉴定、鉴定、PCR技术原理及其与体内技术原理及其与体内DNA复制的比较，血红蛋白的提取与分离、凝胶色谱法等题目难复制的比较，血红蛋白的提取与分离、凝胶色谱法等题目难度相对较大。度相对较大。第17页，本讲稿共17页