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1、微生物实验显微镜直接计数法第1页，本讲稿共14页二、实验原理二、实验原理1.1.血球计数板法血球计数板法 利用计数板上有利用计数板上有固定体积和精确刻度固定体积和精确刻度的两个计数室进行计数，的两个计数室进行计数，是常用的在显微镜下对是常用的在显微镜下对细胞数目细胞数目进行计数的方法。进行计数的方法。具有直观、具有直观、快速等优点，但误差较大，不适合细菌计数。快速等优点，但误差较大，不适合细菌计数。（1 1）计数室体积：正方形，边长为）计数室体积：正方形，边长为1mm1mm，深，深0.1mm0.1mm盖上盖玻片盖上盖玻片后，容积为后，容积为0.1mm0.1mm3 3。（2 2）计数室刻度的规格
2、）计数室刻度的规格16251625型：型：1616个中方格，每个中方格分个中方格，每个中方格分2525个小格；个小格；25162516型：型：2525个中方格，每个中方格分个中方格，每个中方格分1616个小格个小格。第2页，本讲稿共14页计数室计数室 第3页，本讲稿共14页第4页，本讲稿共14页（3 3）计数和计算方法）计数和计算方法我们采用的是我们采用的是25251616的，计数时查的，计数时查5 5个中方格的总菌数。个中方格的总菌数。如图：如图：计算：计算：1 1个计数室的总菌数个计数室的总菌数=A/5=A/52525B B1g1g（mlml）样品中的总菌数）样品中的总菌数=A/5=A/5
3、2525101010001000B B =50,000A =50,000AB B个个5个方格的总菌数个方格的总菌数稀释倍数稀释倍数第5页，本讲稿共14页2.2.测定生长量的其他方法测定生长量的其他方法平板菌落计数法、干重法和比浊法等。平板菌落计数法、干重法和比浊法等。（1 1）平板菌落计数法）平板菌落计数法（2 2）干重法（）干重法（适合浓度较高的样品适合浓度较高的样品）取一定量菌液中取一定量菌液中离心或过滤，分离菌体离心或过滤，分离菌体烘烘干至恒重干至恒重(温度可采用温度可采用105105、100100或或80)80)称重。一般干重为湿重的称重。一般干重为湿重的10%10%-20%-20%。
4、第6页，本讲稿共14页第7页，本讲稿共14页（3 3）比浊法）比浊法在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与吸光值成正比，成正比，即与吸光值成正比，菌数越多，吸光菌数越多，吸光值越大。值越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。该法适合测定浓度较高的样品。该法适合测定浓度较高的样品。第8页，本讲稿共14页三、实验材料三、实验材料1.1.菌种：酵母菌（菌种：酵母菌（Saccharomyces cerevisiaeSacchar
5、omyces cerevisiae）悬液）悬液(已稀释已稀释100100倍倍)2.2.器具：显微镜、血球计数板、吸管、盖玻片。器具：显微镜、血球计数板、吸管、盖玻片。四、实验步骤四、实验步骤1.1.检查计数板检查计数板 检查计数板是否有破损。检查计数板是否有破损。2.2.镜检计数室镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。洗后才能进行计数。第9页，本讲稿共14页3.3.加样品加样品 在清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用细口滴管将酵在清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用细口滴管将酵母菌稀释液由盖玻片
6、边缘点一小滴（不宜过多），让菌液母菌稀释液由盖玻片边缘点一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。充满菌液。注意不可有气泡产生。注意不可有气泡产生。第10页，本讲稿共14页4.4.显微镜计数显微镜计数 静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低倍镜找到计数室，再换成高倍镜进行计数。倍镜找到计数室，再换成高倍镜进行计数。5.5.清洗血球计数板清洗血球计数板 计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干，镜检观察每小格内无残留
7、物为止。行晾干，镜检观察每小格内无残留物为止。第11页，本讲稿共14页五、注意事项五、注意事项1.1.加样前加样前先摇匀菌液先摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生；，计数室中不可有气泡产生；2.2.菌液浓度菌液浓度以每小格有以每小格有5-105-10个菌体为宜。个菌体为宜。3.3.计数时，计数时，格线上的菌体格线上的菌体只数上方和右边线上的；只数上方和右边线上的；4.4.如遇酵母出芽，如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时芽体大小达到母细胞的一半时，作为两，作为两个菌体计算；个菌体计算；5.5.清洗计数板时清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。在水龙头上用水柱清切勿用手或硬物刷洗。在水龙头上用水柱清洗，直到洗净为止。洗，直到洗净为止。6.6.一个样品要从一个样品要从两个计数室中计得的平均值两个计数室中计得的平均值来计算。来计算。第12页，本讲稿共14页特别注意特别注意 血球计数板均有编号，一人一个，血球计数板均有编号，一人一个，务必小心使用，若损坏，需原价赔偿务必小心使用，若损坏，需原价赔偿或赔偿原物！或赔偿原物！第13页，本讲稿共14页显微直接计数结果显微直接计数结果六、作业六、作业1001005个中格总数第14页，本讲稿共14页