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1、实验一实验一 细菌转化细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平E E E Emailmailmailmail：细 菌 转 化第1页/共15页一、实验目的u感受态细胞的制备方法。u掌握质粒DNA转化感受态受体菌技术。第2页/共15页主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平E E E Emailmailmailmail：细 菌 转 化第3页/共15页二、实验原理uu转转化化指指用用氯氯化化钙钙处处理理宿宿主主细细胞胞（大大肠肠杆杆菌菌JM109JM109）,以以利利其其将将DNADNA重重组组子子转转入入细细胞胞内内，在在宿宿主主细细胞胞内内进进行行增殖。增
2、殖。uu感感受受态态细细胞胞：即即通通过过0.1M 0.1M CaCl2CaCl2处处理理细细胞胞，增增加加膜膜对对DNADNA的的通通透透性性，以以增增加加细细胞胞吸吸收收外外源源DNADNA的的效效率率，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。第4页/共15页三、实验器材、试剂1.1.器材：器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇
3、床，培养皿（已铺好固体（已铺好固体LB-AmpLB-Amp），超净工作台，酒精灯，），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。玻璃涂棒，恒温培养箱。2.2.试剂：试剂：30%30%甘油、甘油、0.1M CaCl20.1M CaCl2、氨卞青霉素（、氨卞青霉素（AmpAmp）水溶液、）水溶液、X-galX-gal、IPTGIPTG水溶液、水溶液、LBLB培养液、含培养液、含AmpAmp的的LBLB固体固体平板平板 。第5页/共15页四、感受态细胞的制备1.1.复复苏苏Ecoli Ecoli JM110JM110菌菌株株，于于LBLB平平板板上上划划线线接接种种，3737培养培养9-10h9-1
4、0h。2.2.挑挑单单菌菌落落接接种种于于300mL 300mL LBLB液液体体培培养养基基（三三角角瓶瓶）中中，3737振振荡荡培培养养5-6h5-6h，（或或者者取取原原菌菌1:1001:100加加入入到到LBLB中中，3737振振荡荡培培养养3-4h3-4h）使使细细胞胞处处于于对对数数生生长长期期（用用紫紫外外分分光光光光度度计计测测定定菌菌至至OD600OD600值值达达到到0.4-0.50.4-0.5）。）。3.3.分分装装6 6大大管管，每每管管50mL50mL，冰冰上上预预冷冷30min30min，40004000转转，44离心离心5min5min。第6页/共15页4.4.弃
5、弃上上清清，每每管管加加10mL10mL预预冷冷至至00的的0.1M 0.1M CaCl2CaCl2（液液体体中中有有冰冰粒粒时时效效果果最最好好），合合为为2 2管管后后，每每管管再再补补10mL 10mL 0.1M 0.1M CaCl2CaCl2至至40mL40mL，冰冰浴浴30min30min，40004000转，转，44离心离心5min5min。5.5.弃弃上上清清，每每管管加加10mL10mL预预冷冷至至00的的0.1M 0.1M CaCl2CaCl2后后，重重悬悬菌菌体体沉沉淀淀，合合为为1 1管管，冰冰浴浴10-15min10-15min，即即得得感受态细胞。感受态细胞。四、感受
6、态细胞的制备第7页/共15页6.6.现制现用，或加入现制现用，或加入20mL20mL等体积的等体积的30%30%的灭菌甘油。的灭菌甘油。7.7.分分装装200200管管（每每管管200 200 l l），投投入入液液氮氮快快速速冷冷冻冻后，后，-70-70保存。保存。8.8.用用标标准准质质粒粒进进行行转转化化，若若长长出出许许多多蓝蓝斑斑菌菌落落，证明感受态细胞的效价高。证明感受态细胞的效价高。四、感受态细胞的制备第8页/共15页1.1.取取一一支支感感受受态态细细胞胞在在冰冰上上解解冻冻后后，将将100100 l l感感受态加入到受态加入到1010 l l的连接产物中，混匀。的连接产物中，
7、混匀。2.2.冰浴冰浴30min30min。3.3.4242水浴水浴90sec90sec（其间勿摇晃离心管）。（其间勿摇晃离心管）。4.4.立即冰浴立即冰浴2min2min。5.5.加加入入800800 l l LBLB液液体体培培养养基基（不不加加AmpAmp），于于3737，小于，小于200rpm200rpm振荡培养振荡培养1h1h以复苏细胞。以复苏细胞。五、转化的操作步骤第9页/共15页6.6.给给4 4 l l IPTGIPTG和和4040 l l X-galX-gal充充分分混混匀匀后后用用三三角角玻玻棒棒均均匀匀地地涂涂布布于于含含100100 g/mL g/mL AmpAmp的的
8、LBLB选选择择性性平平板板上上，待待液液体体被被吸吸干干即即可可用用于于涂涂布布转转化化的的细细菌。菌。7.7.将将 复复 苏苏 好好 的的 细细 胞胞 30003000转转 离离 心心 2min2min，丢丢 上上 清清800800 l l，轻柔地将细菌悬浮，涂板。，轻柔地将细菌悬浮，涂板。8.8.待待液液体体完完全全渗渗入入琼琼脂脂后后，倒倒扣扣平平板板，于于3737温温箱中培养箱中培养10h10h以上。以上。9.9.取出置于取出置于44放置数放置数h h，重组子筛选。，重组子筛选。五、转化的操作步骤第10页/共15页六、转化率及其影响因素 uu载体载体DNADNA及重组及重组DNA DNA uu受体细胞受体细胞 uu转化操作转化操作 uu试剂纯度与器皿的洁净度试剂纯度与器皿的洁净度 第11页/共15页参考资料第12页/共15页1.1.影响转化效率的因素有哪些？影响转化效率的因素有哪些？2.2.白色菌落出现的原理是什么？白色菌落出现的原理是什么？思考题第13页/共15页Thanks for your attentionThanks for your attention第14页/共15页