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1、实验实验(shyn)一一 细菌转化细菌转化第一页，共15页。主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平(xn pn)(xn pn)(xn pn)(xn pn)E E E Emailmailmailmail：细 菌 转 化第1页/共15页第二页，共15页。一、实验(shyn)目的u感受态细胞的制备方法。u掌握质粒DNA转化(zhunhu)感受态受体菌技术。第2页/共15页第三页，共15页。主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平(xn pn)(xn pn)(xn pn)(xn pn)E E E Emailmailmailmail：细 菌 转 化第3页/共15页第四页
2、，共15页。二、实验(shyn)原理uu转转 化化 指指 用用 氯氯 化化 钙钙 处处 理理(chl)(chl)宿宿 主主 细细 胞胞（大大 肠肠 杆杆 菌菌JM109JM109）,以以利利其其将将DNADNA重重组组子子转转入入细细胞胞内内，在在宿宿主主细细胞胞内内进行增殖。进行增殖。uu感感受受态态细细胞胞：即即通通过过0.1M 0.1M CaCl2CaCl2处处理理(chl)(chl)细细胞胞，增增加加膜膜对对DNADNA的的通通透透性性，以以增增加加细细胞胞吸吸收收外外源源DNADNA的的效效率率，即即细细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。第4页/共1
3、5页第五页，共15页。三、实验(shyn)器材、试剂1.1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 1.5ml 微微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温量离心管，双面微量离心管架，干式恒温(hngwn)(hngwn)气浴（或恒温气浴（或恒温(hngwn)(hngwn)水浴锅），制冰机，恒温水浴锅），制冰机，恒温(hngwn)(hngwn)摇床，培养皿（已铺好固体摇床，培养皿（已铺好固体LB-AmpLB-Amp），超），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温(hngwn)(hngwn)培养培养箱。箱。2.
4、2.试剂试剂(shj)(shj)：30%30%甘油、甘油、0.1M CaCl20.1M CaCl2、氨卞青霉素（、氨卞青霉素（AmpAmp）水）水溶液、溶液、X-galX-gal、IPTGIPTG水溶液、水溶液、LBLB培养液、含培养液、含AmpAmp的的LBLB固体平板固体平板 。第5页/共15页第六页，共15页。四、感受态细胞(xbo)的制备1.1.复复苏苏Ecoli Ecoli JM110JM110菌菌株株，于于LBLB平平板板上上划划线线接接种种，3737培养培养9-10h9-10h。2.2.挑挑单单菌菌落落接接种种于于300mL 300mL LBLB液液体体培培养养基基（三三角角瓶瓶
5、）中中，3737振振荡荡培培养养5-6h5-6h，（或或者者取取原原菌菌1:1001:100加加入入到到LBLB中中，3737振振荡荡培培养养3-4h3-4h）使使细细胞胞处处于于(chy)(chy)对对数数生生长长期期（用紫外分光光度计测定菌至（用紫外分光光度计测定菌至OD600OD600值达到值达到0.4-0.50.4-0.5）。）。3.3.分分装装6 6大大管管，每每管管50mL50mL，冰冰上上预预冷冷30min30min，40004000转转，44离心离心5min5min。第6页/共15页第七页，共15页。4.4.弃弃上上清清，每每管管加加10mL10mL预预冷冷至至00的的0.1M
6、 0.1M CaCl2CaCl2（液液体体中中有有冰冰粒粒时时效效果果(xiogu)(xiogu)最最好好），合合为为2 2管管后后，每每管管再再补补10mL 10mL 0.1M 0.1M CaCl2CaCl2至至40mL40mL，冰冰浴浴30min30min，40004000转，转，44离心离心5min5min。5.5.弃弃上上清清，每每管管加加10mL10mL预预冷冷至至00的的0.1M 0.1M CaCl2CaCl2后后，重重悬悬菌菌体体沉沉淀淀，合合为为1 1管管，冰冰浴浴10-15min10-15min，即即得得感感受态细胞。受态细胞。四、感受态细胞(xbo)的制备第7页/共15页第
7、八页，共15页。6.6.现制现用，或加入现制现用，或加入20mL20mL等体积的等体积的30%30%的灭菌甘油。的灭菌甘油。7.7.分分装装200200管管（每每管管200 200 l l），投投入入液液氮氮快快速速冷冷冻冻后，后，-70-70保存。保存。8.8.用用标标准准质质粒粒进进行行(jnxng)(jnxng)转转化化，若若长长出出许许多多蓝蓝斑菌落，证明感受态细胞的效价高。斑菌落，证明感受态细胞的效价高。四、感受态细胞(xbo)的制备第8页/共15页第九页，共15页。1.1.取取一一支支感感受受态态细细胞胞在在冰冰上上解解冻冻后后，将将100100 l l感感受受态态加加入到入到10
8、10 l l的连接产物中，混匀。的连接产物中，混匀。2.2.冰浴冰浴30min30min。3.3.4242水浴水浴90sec90sec（其间勿摇晃离心管）。（其间勿摇晃离心管）。4.4.立即冰浴立即冰浴2min2min。5.5.加加入入800800 l l LBLB液液体体(yt)(yt)培培养养基基（不不加加AmpAmp），于于3737，小于，小于200rpm200rpm振荡培养振荡培养1h1h以复苏细胞。以复苏细胞。五、转化(zhunhu)的操作步骤第9页/共15页第十页，共15页。6.6.给给4 4 l l IPTGIPTG和和4040 l l X-galX-gal充充分分混混匀匀后后用
9、用三三角角玻玻棒棒均均匀匀地地涂涂布布于于含含100100 g/mL g/mL AmpAmp的的LBLB选选择择性性平平板板上上，待液体待液体(yt)(yt)被吸干即可用于涂布转化的细菌。被吸干即可用于涂布转化的细菌。7.7.将将复复苏苏好好的的细细胞胞30003000转转离离心心2min2min，丢丢上上清清800800 l l，轻柔地将细菌悬浮，涂板。轻柔地将细菌悬浮，涂板。8.8.待待液液体体(yt)(yt)完完全全渗渗入入琼琼脂脂后后，倒倒扣扣平平板板，于于3737温箱中培养温箱中培养10h10h以上。以上。9.9.取出置于取出置于44放置数放置数h h，重组子筛选。，重组子筛选。五、
10、转化(zhunhu)的操作步骤第10页/共15页第十一页，共15页。六、转化率及其影响(yngxing)因素 uu载体载体(zit)DNA(zit)DNA及重组及重组DNA DNA uu受体细胞受体细胞 uu转化操作转化操作 uu试剂纯度与器皿的洁净度试剂纯度与器皿的洁净度 第11页/共15页第十二页，共15页。参考资料第12页/共15页第十三页，共15页。1.1.影响转化效率的因素有哪些？影响转化效率的因素有哪些？2.2.白色菌落白色菌落(jnlu)(jnlu)出现的原理是什么？出现的原理是什么？思考题第13页/共15页第十四页，共15页。Thanks for your attentionThanks for your attention第14页/共15页第十五页，共15页。