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1、1第一章：取材及固定第一章：取材及固定 一、一、动物致死法动物致死法 1 1、麻醉法、麻醉法 可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有盖玻璃瓶内进行麻醉；也可用盖玻璃瓶内进行麻醉；也可用4%4%戊巴比妥作静脉注射，剂量戊巴比妥作静脉注射，剂量按动物体重按动物体重1ml/kg1ml/kg；或用；或用20%20%氨基甲酸乙脂作腹腔注射，剂氨基甲酸乙脂作腹腔注射，剂量一般按动物体重量一般按动物体重5ml/kg5ml/kg。2 2、空气栓塞法、空气栓塞法 如家兔可用如家兔可用50ml50ml注射器将空气由耳静脉推入，使动物很快死注射器将空
2、气由耳静脉推入，使动物很快死亡。亡。第1页/共56页2 3 3、击头法、击头法 如大、小鼠，可用重物击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最如大、小鼠，可用重物击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死。好一击而死。4 4、断头法、断头法 青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，较大动物如兔青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，较大动物如兔子等，可用斧头迅速砍头致死。子等，可用斧头迅速砍头致死。5 5、股动脉放血法、股动脉放血法 动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。注意：上述各法，应根据制片需要选用，如空气栓塞法不宜注意：上述各法，应根
3、据制片需要选用，如空气栓塞法不宜用作血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下神经部分泌物用作血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下神经部分泌物染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。第2页/共56页3 二、二、取材注意事项取材注意事项 1 1、材料新鲜、材料新鲜 最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。2 2、组织块力求小而薄、组织块力求小而薄 组织块的厚度以不超过组织块的厚度以
4、不超过5 5毫米为宜，较理想的厚度为毫米为宜，较理想的厚度为2 2毫米左毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。3 3、勿使组织块受挤压、勿使组织块受挤压 切取组织块时刀剪要锋利，不要来回挫动，夹取组织时切勿切取组织块时刀剪要锋利，不要来回挫动，夹取组织时切勿猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。第3页/共56页4 4 4、尽量保持组织的原有形态、尽量保持组织的原有形态 新鲜组织经固定后，或多或少产生收缩现象，为此可将组织新鲜组织经固定后，或多或少产生收缩现象，为此可将组织展平，以尽
5、可能维持原形。展平，以尽可能维持原形。5 5、要熟悉取材部位、要熟悉取材部位 要能准确的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰要能准确的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部；肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部。腺尾部；肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部。6 6、动物品种的选择、动物品种的选择 如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片为佳，欲观察运动终板，可用小鼠的肋间肌等。片为佳，欲观察运动终板，可用小鼠的肋间肌等。第4页/共56页5 7 7、选好组织块的切面、选好组织块的切面 熟悉某些器官组织成分安
6、排，然后决定其切面的走向；如一熟悉某些器官组织成分安排，然后决定其切面的走向；如一长管状器官以横切面较好。长管状器官以横切面较好。8 8、保持材料的清洁、保持材料的清洁 组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。9 9、切除不需要的部分、切除不需要的部分 特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，否则给固定、特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，否则给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。第
7、5页/共56页6 三、三、组织固定法组织固定法 （一）、固定的方法（一）、固定的方法 1 1、小块组织固定法、小块组织固定法：从人体和动物取下的小块组织，立即：从人体和动物取下的小块组织，立即置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。2 2、注射、灌注固定法、注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。这时极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。这时宜采用注射固定法，将固定液注入血管，经血管分支到达整宜采用注射固定法，将固定液注入血管，经
8、血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。个组织和全身，从而得到充分的固定。3 3、蒸汽固定法、蒸汽固定法:比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醛蒸汽比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。第6页/共56页7 （二）、固定的目的（二）、固定的目的 1 1、迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐、迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。败，使之尽量保持生前的状态与结构。2 2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分
9、转变为不溶性物质，以保持其原有状态。为不溶性物质，以保持其原有状态。3 3、使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以、使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察。便染色后易于鉴别和观察。第7页/共56页8 4 4、使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程、使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏。中不易损坏。5 5、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，经、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，经染色处理后易于辨认。染色处理后易于辨认。6 6、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。结构。7 7、使组织块硬化，便于制作薄片。、使
10、组织块硬化，便于制作薄片。第8页/共56页9 （三）、注意事项及影响固定的因素（三）、注意事项及影响固定的因素 1 1、组织块不易过大，一般以厚度、组织块不易过大，一般以厚度5mm5mm，长宽不超过，长宽不超过1515mm1515mm。2 2、固定液的量一般以组织块大小的、固定液的量一般以组织块大小的2020倍为宜。倍为宜。3 3、必须选择渗透力强，又不使组织过渡收缩或膨、必须选择渗透力强，又不使组织过渡收缩或膨胀的试剂作为固定液。胀的试剂作为固定液。4 4、有的固定剂是由氧化剂与还原剂混合而成，如、有的固定剂是由氧化剂与还原剂混合而成，如甲醛（还原剂）与重铬酸钾（氧化剂）混合成的甲醛（还原剂
11、）与重铬酸钾（氧化剂）混合成的HellyHelly液等。液等。第9页/共56页10 5 5、固定时间的长短视固定剂的不同要求而定，、固定时间的长短视固定剂的不同要求而定，也与气温、组织块的大小有关。温度高时则时间也与气温、组织块的大小有关。温度高时则时间缩短，组织块过大则应延长固定时间。缩短，组织块过大则应延长固定时间。6 6、软组织或较大组织可先经、软组织或较大组织可先经2-32-3小时固定后再小时固定后再修整成小块重新投入新配制的固定液内继续固定。修整成小块重新投入新配制的固定液内继续固定。7 7、特殊要求的组织，常需要特殊的固定液，所、特殊要求的组织，常需要特殊的固定液，所以，取组织之前
12、应做好准备。如各种神经组织因以，取组织之前应做好准备。如各种神经组织因显示内容不同，需不同的固定液与固定方法。显示内容不同，需不同的固定液与固定方法。第10页/共56页11 （四）、固定液（四）、固定液 1 1、固定液种类、固定液种类：一类是单纯固定液，即只有一种试：一类是单纯固定液，即只有一种试剂；另一类是混合固定液，由两种或两种以上试剂剂；另一类是混合固定液，由两种或两种以上试剂组成。组成。作为较好的固定液，应有下列特性，作为较好的固定液，应有下列特性，首先首先，有，有强渗透力，能迅速的渗入组织内部；强渗透力，能迅速的渗入组织内部；其次其次，不使组，不使组织过渡收缩或膨胀，并能使组织内欲观
13、察的成分得织过渡收缩或膨胀，并能使组织内欲观察的成分得以凝固为不溶性物质；以凝固为不溶性物质；最后最后，能使组织达到一定的，能使组织达到一定的硬度并获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的硬度并获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力。亲和力。第11页/共56页12 2 2、单纯固定液、单纯固定液 （1 1）酒精：）酒精：既是配制混合固定液的基本成分，既是配制混合固定液的基本成分，又可作为单纯固定液使用。用于固定时以又可作为单纯固定液使用。用于固定时以80%-80%-95%95%浓度为好。缺点是经酒精固定的组织容易变浓度为好。缺点是经酒精固定的组织容易变硬，对组织收缩较大。硬，对组织收缩较大
14、。（2 2）甲醛水溶液甲醛水溶液：常用的甲醛水溶液即市售的：常用的甲醛水溶液即市售的福尔马林，常用浓度为福尔马林，常用浓度为10%10%，指以，指以10ml10ml的商品甲的商品甲醛（醛（37%-40%37%-40%甲醛水溶液）加入甲醛水溶液）加入90ml90ml水配成的，水配成的，此液实际上只有此液实际上只有4%4%的甲醛。的甲醛。第12页/共56页13 （3 3）醋酸：）醋酸：亦名乙酸，能与酒精、水、氯仿等多亦名乙酸，能与酒精、水、氯仿等多种试剂混合，故为许多混合固定液成分之一，其种试剂混合，故为许多混合固定液成分之一，其穿透速度很快，固定小组织仅穿透速度很快，固定小组织仅1h1h即可，对
15、组织和即可，对组织和细胞有膨胀作用，且不能凝固细胞质中的蛋白质，细胞有膨胀作用，且不能凝固细胞质中的蛋白质，一般与引起收缩的固定液一起使用，以达到平衡一般与引起收缩的固定液一起使用，以达到平衡目的。目的。（4 4）苦味酸）苦味酸：苦味酸能沉淀蛋白质，对脂肪、类：苦味酸能沉淀蛋白质，对脂肪、类脂无作用，渗透力较弱，很少单独使用，固定后脂无作用，渗透力较弱，很少单独使用，固定后收缩明显，用含苦味酸的固定液固定组织一般不收缩明显，用含苦味酸的固定液固定组织一般不宜超过宜超过2424小时。小时。第13页/共56页14 （5 5）重铬酸钾：）重铬酸钾：其穿透速度快，对组织收缩小并其穿透速度快，对组织收缩
16、小并稍有膨胀，重铬酸钾常备水溶液为稍有膨胀，重铬酸钾常备水溶液为3-5%3-5%。其混合。其混合固定液，如固定液，如ZenkerZenker液、液、HellyHelly液及液及RegaudRegaud液等被广液等被广泛用于组织学，泛用于组织学，凡经重铬酸钾、铬酸、铬酸盐固凡经重铬酸钾、铬酸、铬酸盐固定的组织，必须以流水冲洗后方能转入脱水剂。定的组织，必须以流水冲洗后方能转入脱水剂。（6 6）锇酸）锇酸：锇酸一般只用于某些特殊染色或电镜：锇酸一般只用于某些特殊染色或电镜切片染色或固定，配制时要用洗涤干净的玻塞棕切片染色或固定，配制时要用洗涤干净的玻塞棕色瓶，最好用双蒸水配制，锇酸穿透力弱，且易色
17、瓶，最好用双蒸水配制，锇酸穿透力弱，且易使组织硬脆，因此它固定的组织必须小而薄，体使组织硬脆，因此它固定的组织必须小而薄，体积最好在积最好在3 33 32mm2mm以内。以内。第14页/共56页15 （7 7）铬酸：）铬酸：铬酸能沉淀蛋白质，适用于核蛋白的铬酸能沉淀蛋白质，适用于核蛋白的固定，并能增强核的染色能力，穿透速度慢，一固定，并能增强核的染色能力，穿透速度慢，一般组织块的固定，需经般组织块的固定，需经12-24h12-24h，硬化程度中等，硬化程度中等，收缩显著，除用作固定液外，万分之一的铬酸水收缩显著，除用作固定液外，万分之一的铬酸水溶液，可制作分离标本。溶液，可制作分离标本。（8
18、8）丙酮）丙酮：丙酮能使蛋白质沉淀，渗透力强，但：丙酮能使蛋白质沉淀，渗透力强，但对核固定欠佳，且使组织剧烈收缩。广泛用于组对核固定欠佳，且使组织剧烈收缩。广泛用于组织化学中酶的固定，其作用基本与酒精相同。织化学中酶的固定，其作用基本与酒精相同。（9 9）三氯醋酸）三氯醋酸：作用与醋酸相似，很少单独使用，：作用与醋酸相似，很少单独使用，在混合固定液中对组织起膨胀作用。在混合固定液中对组织起膨胀作用。第15页/共56页16 3 3、常用混合固定液、常用混合固定液 （1 1）BouinBouin液：液：饱和苦味酸水溶液：饱和苦味酸水溶液：75ml75ml；甲醛；甲醛水溶液（水溶液（40%40%）：
19、）：25ml25ml；冰醋酸：；冰醋酸：5ml5ml。三者在配。三者在配方中的实际比例为方中的实际比例为1 1：5 5：1515，为实验室常用固定，为实验室常用固定剂，其渗透力强，对组织固定均匀且收缩较小，剂，其渗透力强，对组织固定均匀且收缩较小，染色效果好。冰醋酸固定染色质，苦味酸使组织染色效果好。冰醋酸固定染色质，苦味酸使组织适当硬化，甲醛水溶液调节两种试剂对组织的膨适当硬化，甲醛水溶液调节两种试剂对组织的膨胀作用。其固定时间以胀作用。其固定时间以12-24h12-24h为宜。为宜。第16页/共56页17 （2 2）CarnoyCarnoy液液：冰冰醋醋酸酸一一份份，氯氯仿仿三三份份，无无
20、水水酒酒精精六六份份。此此液液浸浸透透速速度度快快，固固定定时时间间不不宜宜过过长长，小小块块组组织织2-32-3小小时时即即可可，固固定定后后直直接接入入无无水水酒酒精精脱脱水水。常常用用于于糖糖原原及及尼尼氏氏体体固固定定。一一般般固固定定时时须须放放在在冰冰箱箱中中，低温环境可明显减少收缩作用。低温环境可明显减少收缩作用。（3 3）中中性性甲甲醛醛液液：最最常常用用的的固固定定液液之之一一，配配方方:40%:40%甲甲醛醛120ml,120ml,蒸蒸馏馏水水880ml880ml，磷磷酸酸二二氢氢钠钠4g4g，磷磷酸酸氢氢二二钠钠13g13g，pH7.0pH7.0。（4 4）中中性性缓缓冲
21、冲甲甲醛醛液液：为为免免疫疫组组织织化化学学最最常常用用的的固固定定液液。固固定定时时间间24h24h为为宜宜，配配方方：40%40%甲甲醛醛10ml10ml，0.01mol/LpH7.40.01mol/LpH7.4的的PBS90mlPBS90ml第17页/共56页18第二章：固定后处理及切片第二章：固定后处理及切片 一、一、洗涤与修切洗涤与修切 1 1、水洗法、水洗法 一般常用流水冲洗，凡用含铬或锇的固定液固定的组织块，一般常用流水冲洗，凡用含铬或锇的固定液固定的组织块，必须用流水冲洗必须用流水冲洗24h24h左右。常用的固定液为左右。常用的固定液为10%10%的甲醛水溶液，的甲醛水溶液，也
22、必须用流水冲洗，一般时间也为也必须用流水冲洗，一般时间也为24h24h左右，固定时间长的左右，固定时间长的标本，冲洗时间也应延长。标本，冲洗时间也应延长。2 2、酒精洗涤法、酒精洗涤法 凡含苦味酸或酒精的固定液固定的组织块，大多采用酒精洗凡含苦味酸或酒精的固定液固定的组织块，大多采用酒精洗涤，如苦味酸影响着色，但易溶于涤，如苦味酸影响着色，但易溶于70%70%酒精。酒精。第18页/共56页19 二、二、取材注意事项取材注意事项 1 1、材料新鲜、材料新鲜 最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器的上皮组织最易变质，应争取在死后半小
23、时内处理完毕。的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。2 2、组织块力求小而薄、组织块力求小而薄 组织块的厚度以不超过组织块的厚度以不超过5 5毫米为宜，较理想的厚度为毫米为宜，较理想的厚度为2 2毫米左毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。3 3、勿使组织块受挤压、勿使组织块受挤压 切取组织块时刀剪要锋利，不要来回挫动，夹取组织时切勿切取组织块时刀剪要锋利，不要来回挫动，夹取组织时切勿猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。第19页/共56页20 三、三、脱水与透明脱水与
24、透明 （一）、脱水的意义与目的（一）、脱水的意义与目的 组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水，脱能混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水，脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。脱水时必水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。脱水时必须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂，须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂，以防组织过度收缩而变形，或脱水不完全而影响制以防组织过度收缩而变形，或脱水不完全而影响制片效果。脱水剂必须具有下列特性片效果。脱水剂必须具有下列特性:脱水剂能与水脱水剂能与水按比例混合；高浓度，一般指
25、不含水分；脱水剂也按比例混合；高浓度，一般指不含水分；脱水剂也能与透明剂混合。能与透明剂混合。第20页/共56页21 1 1、脱水剂、脱水剂 （1 1）酒精：）酒精：是最常用的脱水剂，脱水能力强，是最常用的脱水剂，脱水能力强，并能使组织硬化。其主要缺点是易使组织收缩、并能使组织硬化。其主要缺点是易使组织收缩、变脆，故应勿直接用高浓度酒精，一般从变脆，故应勿直接用高浓度酒精，一般从70%70%酒酒精开始；脱水时间勿过长。在精开始；脱水时间勿过长。在70%70%可长时间保存。可长时间保存。（2 2）丙酮丙酮：脱水作用比酒精强，但对组织块的：脱水作用比酒精强，但对组织块的收缩较大，价格较高，主要用于
26、快速脱水或固定收缩较大，价格较高，主要用于快速脱水或固定兼脱水，脱水时间一般为兼脱水，脱水时间一般为1-3h1-3h左右。左右。第21页/共56页22 （3 3）正丁醇和叔丁醇：）正丁醇和叔丁醇：正丁醇是无色液体，脱正丁醇是无色液体，脱水能力较弱，可和水、酒精和石蜡互溶，因此这水能力较弱，可和水、酒精和石蜡互溶，因此这种脱水的组织块可直接浸蜡和包埋。叔丁醇是目种脱水的组织块可直接浸蜡和包埋。叔丁醇是目前常用的一种脱水剂，它不易使组织收缩或变硬前常用的一种脱水剂，它不易使组织收缩或变硬，且脱水后不经透明直接浸蜡，电镜标本制作时，且脱水后不经透明直接浸蜡，电镜标本制作时常用作中间脱水剂。常用作中间
27、脱水剂。（4 4）其余脱水剂其余脱水剂：还可以用作脱水剂的有：异：还可以用作脱水剂的有：异丙醇、还氧己烷、四氢呋喃、环己酮和松脂醇等丙醇、还氧己烷、四氢呋喃、环己酮和松脂醇等，但由于某些原因，现在都不常用。，但由于某些原因，现在都不常用。第22页/共56页23 2 2、透明或媒浸、透明或媒浸 （1 1）二甲苯：）二甲苯：是最常用的常规透明剂，它对组织是最常用的常规透明剂，它对组织的收缩性强，易使组织变硬变脆，在二甲苯中一的收缩性强，易使组织变硬变脆，在二甲苯中一般般30min30min即可使组织透明，组织块可先经过无水即可使组织透明，组织块可先经过无水酒精酒精-二甲苯混合液处理，再浸入二甲苯。
28、也常二甲苯混合液处理，再浸入二甲苯。也常用于切片染色后透明，且不会使染料退色。用于切片染色后透明，且不会使染料退色。（2 2）苯和甲苯苯和甲苯：对组织收缩性较小，与二甲苯相：对组织收缩性较小，与二甲苯相比不易使组织变脆，但透明速度慢且挥发快，适比不易使组织变脆，但透明速度慢且挥发快，适用于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透用于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透明。明。第23页/共56页24 （3 3）氯仿：）氯仿：不易使组织变硬变脆，但透明能力比不易使组织变硬变脆，但透明能力比二甲苯差，用作透明剂时，多用于大块组织的透二甲苯差，用作透明剂时，多用于大块组织的透明（明（1cm1cm），而
29、且在容器内放置无水硫酸铜。），而且在容器内放置无水硫酸铜。（4 4）其他透明剂）其他透明剂：四氯化碳、苯甲酸甲酯和水杨：四氯化碳、苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯、香柏油（皮肤、子宫、肌肉和肌腱）、酸甲酯、香柏油（皮肤、子宫、肌肉和肌腱）、松油醇、丁香油、冬青油与苯胺油和火棉胶包埋松油醇、丁香油、冬青油与苯胺油和火棉胶包埋的媒浸液等。的媒浸液等。第24页/共56页25 3 3、浸蜡、浸蜡 组织经透明后，在溶化的石蜡内浸渍的过程组织经透明后，在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点为称浸蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-5652-56，在夏天较热时一般用高熔点石蜡，在冬天气温较在夏天较热时一
30、般用高熔点石蜡，在冬天气温较低时用低熔点石蜡，主要是有利于切片的制作。低时用低熔点石蜡，主要是有利于切片的制作。时间不易过长，否则容易造成组织脆硬，时间不时间不易过长，否则容易造成组织脆硬，时间不足，也难制作良好的切片。足，也难制作良好的切片。第25页/共56页26 四、四、组织的包埋与包埋方法组织的包埋与包埋方法 组织块经过浸透剂浸透后，再用包埋剂（石蜡、组织块经过浸透剂浸透后，再用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋。不同火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋。不同的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成组织的的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成组织的块。经过包埋后，可使组
31、织达到一定的硬度和韧度，块。经过包埋后，可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。有利于切成薄片。第26页/共56页27 （一）、石蜡包埋法（一）、石蜡包埋法 石石蜡蜡包包埋埋法法为为组组织织学学技技术术中中最最常常用用的的一一种种包包埋埋法法。石石蜡蜡具具有有不不同同的的熔熔点点，夏夏天天一一般般用用5050以以上上熔熔点点（硬硬蜡蜡）石石蜡蜡包包埋埋，冬冬天天用用5050以以下下熔熔点点（软软蜡蜡）石石蜡蜡包包埋埋，软软的的组组织织用用软软蜡蜡包包埋埋，硬硬的的组组织织用用硬硬蜡蜡包包埋埋，一一般般常常用用的的包包埋埋熔熔点点使使52-5652-56，如如果果需需要要切切4 4微微米米
32、以以下下的的切切片片，则则用用56-60 56-60 的的石石蜡蜡，较较厚厚的的切切片片则则用用熔熔点点为为52-5452-54的的石石蜡蜡。新新蜡蜡必必须须在在温温箱箱内内溶溶化化一一次次，以以使使其其所所含含的的挥挥发发性性物物质质蒸蒸发发，无无论新蜡和旧蜡都必须加热过滤后再包埋。论新蜡和旧蜡都必须加热过滤后再包埋。第27页/共56页28 （二）、石蜡包埋法包埋过程（二）、石蜡包埋法包埋过程 组组织织块块透透明明后后，即即可可放放入入已已熔熔的的石石蜡蜡内内浸浸蜡蜡；一一般般厚厚度度约约5mm5mm的的实实质质性性器器官官，总总的的浸浸蜡蜡时时间间约约2-2-3h3h，均均在在恒恒温温箱箱
33、内内进进行行。较较理理想想的的的的浸浸蜡蜡温温度度是是石石蜡蜡刚刚溶溶化化的的温温度度，或或在在蜡蜡杯杯底底部部尚尚残残留留一一小小部部分分未未熔熔完完蜡蜡时时的的温温度度，浸浸蜡蜡完完成成后后，即即做做成成包包有有组组织织的的蜡蜡块块。包包埋埋蜡蜡块块的的器器材材有有专专用用的的包包埋埋框框，也也有有自自己己制制作作的的包包埋埋盒盒，只只要要是是具具有有一一定定形形状状的的容容器器，我我们们都可以把它用作包埋盒。都可以把它用作包埋盒。包埋的具体过程详述。包埋的具体过程详述。第28页/共56页29 （三）、其他包埋法（三）、其他包埋法 除除上上述述常常用用包包埋埋法法以以外外，还还有有其其他他
34、一一些些包包埋埋方方法法，如如塑塑料料包包埋埋法法、碳碳蜡蜡包包埋埋法法、明明胶胶包包埋埋法法、松松脂脂醇醇包包埋埋法法、甲甲基基丙丙烯烯酸酸甲甲酯酯包包埋埋法法、双双重重包包埋埋法法及及二二甲氧基丙烷石蜡包埋法等。甲氧基丙烷石蜡包埋法等。第29页/共56页30 （五）、火棉胶包埋法（五）、火棉胶包埋法 火火棉棉胶胶常常用用于于大大块块组组织织的的包包埋埋。课课避避免免纤纤维维组组织织和和肌肌肉肉组组织织的的过过度度硬硬化化，减减少少纤纤维维组组织织的的收收缩缩和和扭转，利于保持原有的组织结构。扭转，利于保持原有的组织结构。（六）、树脂包埋法（六）、树脂包埋法 树树脂脂包包埋埋法法适适用用于于
35、不不脱脱钙钙骨骨髓髓活活检检组组织织，肝肝、肾肾穿穿刺刺活活检检和和淋淋巴巴组组织织等等，可可观观察察细细胞胞的的细细微微结结构构。树树脂脂选选用用亲亲水水性性甲甲基基丙丙烯烯酸酸-2-2-羟羟基基乙乙基基酯酯，组组织织不需脱水，对细胞形态影响轻。不需脱水，对细胞形态影响轻。第30页/共56页31 五、五、切片切片 石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介制作切石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介制作切片的。片的。切片前的处理：切片前的处理：A:A:修切蜡块：修切蜡块：切片前应先修块，即切去组织切片前应先修块，即切去组织周围过多的石蜡，一般留下至少约周围过多的石蜡，一般留下至少约2mm2mm宽度的蜡边
36、宽度的蜡边为宜。注意蜡块不能留得太窄，在切片时易损坏组为宜。注意蜡块不能留得太窄，在切片时易损坏组织；蜡边不能留得太多，否则影响展片。织；蜡边不能留得太多，否则影响展片。室温过高室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。第31页/共56页32 B:B:切片用品准备切片用品准备 （1 1）切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换）切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换 新的一次性切片，切片刀对组织块的倾角非常重要，新的一次性切片，切片刀对组织块的倾角非常重要，一般在一般在1010以内，过小则组织块不能先与刀刃的刀以内，过小则组织块不能先与刀刃的刀口接
37、触，过大时，使刀口刮组织蜡块表面，切片易口接触，过大时，使刀口刮组织蜡块表面，切片易碎。碎。（2 2）载物片：载物片经清洁液、）载物片：载物片经清洁液、95%95%乙醇处理后备乙醇处理后备用。用。（3 3）展片仪：加入温水，接通电源，调整温度）展片仪：加入温水，接通电源，调整温度 （4 4）其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、等。）其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、等。第32页/共56页33 六、六、粘片粘片 粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻片上，借粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻片上，借水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，以便染色和镜检。
38、以便染色和镜检。粘片有两种方式：粘片有两种方式：水捞法水捞法将一个盛水的容器加将一个盛水的容器加热至热至35-4035-40，将蜡带光泽面向下铺于温水上，待，将蜡带光泽面向下铺于温水上，待蜡片伸展平整后，即可用长镊子分离每一个蜡片，蜡片伸展平整后，即可用长镊子分离每一个蜡片，再用载玻片伸入水中，从蜡片下面捞起，直立玻片再用载玻片伸入水中，从蜡片下面捞起，直立玻片使水流掉并置温箱内烘干。使水流掉并置温箱内烘干。第33页/共56页34 干粘法干粘法可将已经切离的蜡片单个的放在加可将已经切离的蜡片单个的放在加有数滴蒸馏水的载玻片上，然后在酒精灯上摇晃烘有数滴蒸馏水的载玻片上，然后在酒精灯上摇晃烘烤，
39、此时应注意控制水的温度勿使过高，待蜡片平烤，此时应注意控制水的温度勿使过高，待蜡片平整后，倾去玻片上的水，用细针调正蜡片的位置，整后，倾去玻片上的水，用细针调正蜡片的位置，继续在酒精灯上烘烤至蜡片呈半透明状为止，以后继续在酒精灯上烘烤至蜡片呈半透明状为止，以后在温箱内烘干即可。当蜡片已放在有水的载玻片上在温箱内烘干即可。当蜡片已放在有水的载玻片上后，可不经酒精灯烘烤，而在调好温度的电热板上后，可不经酒精灯烘烤，而在调好温度的电热板上烘烤。烘烤。第34页/共56页35第三章：染料、常用染液及常第三章：染料、常用染液及常规苏木素规苏木素-伊红染色法伊红染色法 一、一、染料性质染料性质 染料：含有发
40、色团的有机化合物染料：含有发色团的有机化合物盐类物质盐类物质溶解于水并具有电荷溶解于水并具有电荷组织着色组织着色碱性染料：具有阳电荷。含氨基（碱性染料：具有阳电荷。含氨基（-NH-NH2 2)、二甲氨基二甲氨基-N(CH-N(CH3 3)2 2等碱性助色团。等碱性助色团。酸性染料：具有阴电荷。含羧基（酸性染料：具有阴电荷。含羧基（-OOH-OOH）、）、羟基（羟基（-OH-OH）或磺基（）或磺基（-SO-SO3 3H H）等酸性助色团。等酸性助色团。第35页/共56页36 二、染色原理二、染色原理：嗜嗜碱碱性性：细细胞胞和和组组织织中中的的酸酸性性物物质质或或结结构构（嗜嗜碱碱性性物质）与碱性
41、染料亲和力强。物质）与碱性染料亲和力强。嗜嗜酸酸性性：细细胞胞和和组组织织中中的的碱碱性性物物质质或或结结构构（嗜嗜酸酸性性物质）与酸性染料亲和力强。物质）与酸性染料亲和力强。中性：中性：与两种染料的亲和力均不强。与两种染料的亲和力均不强。在在组组织织染染色色中中所所谓谓的的“嗜嗜酸酸性性”及及“嗜嗜碱碱性性”一一词词，是是说说该该物物质质易易被被酸酸性性或或碱碱性性染染料料所所染染，而而细细胞本身的酸性或碱性正与其相反。胞本身的酸性或碱性正与其相反。第36页/共56页37 三、常用染液及染色法三、常用染液及染色法：1 1、细胞核常用染色法、细胞核常用染色法 A A：苏苏木木精精-苏苏木木精精
42、是是从从苏苏木木用用乙乙醚醚连连续续提提取取的的淡淡黄黄色色或或棕棕黄黄色色结结晶晶，溶溶于于酒酒精精，甘甘油油及及热热水水中中。苏苏木木精精不不能能单单独独使使用用，主主要要是是对对组组织织的的亲亲和和力力小小，欲欲使使其其成成为为一一种种染染料料，必必须须在在苏苏木木精精溶溶液液中中加加入入复复盐盐和和氧氧化化剂剂。配配制制苏苏木木精精的的常常用用氧氧化化剂剂有有过过锰锰酸酸钾钾、氧氧化化汞汞、碘碘酸酸钠钠及及过过氧氧化化氢氢等等，或或将将配配置置好好的的苏苏木木精精在在空空气气中中自自然然氧氧化化，所所以以放放置置时时间间较较长长的的苏苏木木精精染染液染色效果较好。液染色效果较好。第37
43、页/共56页38 B B：硫硫堇堇或或甲甲苯苯胺胺蓝蓝染染色色法法-切切片片入入1%1%硫硫堇堇或或甲甲苯苯胺胺蓝蓝水水溶溶液液染染12-24h12-24h，然然后后95%95%酒酒精精分分色色，结结果果：核核蓝蓝色色，粘液，软骨基质，肥大细胞颗粒呈蓝紫色。粘液，软骨基质，肥大细胞颗粒呈蓝紫色。C C：碱碱性性品品红红-碱碱性性品品红红对对显显示示多多数数糖糖类类及及弹弹性性纤纤维维效效果果良良好好，也也可可显显示示核核酸酸。作作为为细细胞胞核核的的一一般般染染色色，可可用用0.5-1%0.5-1%水溶液染色数分钟。水溶液染色数分钟。D D：媒媒染染染染料料细细胞胞核核染染色色法法-指指在在配
44、配制制染染料料时时需需加加入入一一些些媒媒染染剂剂如如氯氯化化铝铝，铝铝矾矾等等类类似似的的复复盐盐才才易易着着色色。如如天天青青石石蓝蓝B B染染色色法法：天天青青石石蓝蓝B0.1B0.1克克，铁铁矾矾5 5克克，蒸蒸馏馏水水100ml100ml，混混合合后后煮煮沸沸数数分分钟钟，冷冷后后过过滤滤，切切片片染染2-32-3分钟，此液可代替苏木精染细胞核。分钟，此液可代替苏木精染细胞核。第38页/共56页39 2 2、细胞质常用染色法、细胞质常用染色法 A A：伊伊红红-伊伊红红种种类类很很多多，但但常常用用为为伊伊红红B B和和伊伊红红Y Y。同同时时一一般般均均配配成成0.5-1%0.5-
45、1%水水溶溶液液或或酒酒精精溶溶液液，在在染染蓝蓝色核后，经伊红复染，最后用色核后，经伊红复染，最后用95%95%酒精分色酒精分色。B B：酸酸性性品品红红-酸酸性性品品红红常常用用于于结结缔缔组组织织染染色色，染染色色后色泽鲜艳，缺点是易于退色，不易长久保持。后色泽鲜艳，缺点是易于退色，不易长久保持。C C：藻红：藻红-使用法与伊红相同。使用法与伊红相同。D D：焰红：焰红-使用法与伊红相同。使用法与伊红相同。第39页/共56页40 四、苏木精四、苏木精-伊红染色法伊红染色法：为为最最常常用用及及最最普普通通的的染染色色方方法法。一一般般观观察察的的组组织切片都用本法染色。简称：织切片都用本
46、法染色。简称：HEHE染色。染色。苏木精苏木精伊伊 红红嗜碱性结构：嗜碱性结构：细胞核粗面内质网游离核糖体等嗜酸性结构：嗜酸性结构：细胞质基质溶酶体、线粒体等细胞器胶原纤维等第40页/共56页41 五、染色后透明封片五、染色后透明封片：经经过过HEHE染染色色后后，通通过过各各梯梯度度酒酒精精后后进进入入二二甲甲苯苯溶溶液液，其其主主要要作作用用是是透透明明组组织织，透透明明后后在在组组织织块块处处滴滴上上树树胶胶后后用用盖盖玻玻片片分分片片，自自然然干干燥燥后后即即可可在在显显微微镜下观察。镜下观察。第41页/共56页42石蜡切片法石蜡切片法 组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成组织经石
47、蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。一般切切片的过程称为石蜡切片法。一般切5-85-8微米的厚微米的厚度，要观察病变的连续性可制作连续切片。除此之度，要观察病变的连续性可制作连续切片。除此之外，石蜡包埋的组织块便于长期保存，因此，石蜡外，石蜡包埋的组织块便于长期保存，因此，石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用，最普遍切片仍是目前各种切片制作方法中最常用，最普遍的一种方法。的一种方法。第四章：石蜡切片法制作过程第四章：石蜡切片法制作过程第42页/共56页43 切片法主要步骤切片法主要步骤 1 1、取材与固定、取材与固定 （1 1）取材：）取材：从动物体取下所需的器官材料
48、。取从动物体取下所需的器官材料。取材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立即取材，防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋即取材，防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄（以不超过利；所取材料力求小而薄（以不超过0.5cm0.5cm为宜），为宜），不能挤压和损伤。不能挤压和损伤。第43页/共56页44 （2 2）固固定定：将将所所取取的的材材料料立立即即投投入入固固定定液液中中，目目的的是是使使组组织织蛋蛋白白迅迅速速凝凝固固，使使细细胞胞内内的的结结构构和和成成分分不不再再发发生生变变化化，保保持持组组织织细细胞胞与与活活体体相相
49、似似的的形形态态结结构构，固固定定后后的的组组织织块块变变硬硬，便便于于进进一一步步处处理理。常常用用的的固固定定剂剂有有甲甲醛醛、乙乙醇醇、苦苦味味酸酸或或混混合合固固定定液液。实实验验室室常常用用BouinBouin固固定定液液，固固定定时时间间为为12122424小小时时，其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。第44页/共56页45 2 2、脱水与透明、脱水与透明 （1 1）脱脱水水：固固定定后后的的组组织织块块内内含含有有的的大大量量水水分分要要彻彻底底脱脱去去，以以便便石石蜡蜡的的浸浸入入。常常用用的的脱脱水水剂剂为为乙乙醇醇，脱脱水
50、水过过程程必必须须循循序序渐渐进进，从从低低浓浓度度开开始始，逐逐步步升升高高，使使组组织织块块中中的的水水分分逐逐渐渐被被乙乙醇醇所所取取代代。具具体体操操作作为为：BouinBouin固固定定液液固固定定的的组组织织块块可可直直接接进进入入7070的的乙乙醇醇进进行行脱脱水水，时时间间1212小小时时左左右右。（若若材材料料暂暂不不制制片片，可可保保存存于于7070乙乙醇醇中中。）然然后后将将组组织织块块依依次次移移入入8585乙乙醇醇（）、（）各各8-128-12小小时时，9595乙乙醇醇（）、（）各各2 2小小时时，100100乙乙醇醇（）、（）各各1 1小小时时。因因无无水水乙乙醇醇