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1、重要动物组织切片制作技术1现在学习的是第1页，共52页 3 3、击头法、击头法如大、小鼠，可用重物如大、小鼠，可用重物击头后部或将其后部或将其头后部猛撞桌沿，最好一后部猛撞桌沿，最好一击而死。而死。4 4、断头法、断头法 青蛙、小鼠等小青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其物，可用剪刀剪去其头部，部，较大大动物如兔子等，可用物如兔子等，可用斧斧头迅速砍迅速砍头致死。致死。5 5、股动脉放血法、股动脉放血法 动物物经吸入乙吸入乙醚或或氯仿稍麻醉后，立即切开股仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。脉放血。注意：上述各法，注意：上述各法，应根据制片需要根据制片需要选用，如空气栓塞法不宜用用，如空气栓塞法不宜用
2、作血管注射作血管注射标本的制作；乙本的制作；乙醚麻醉麻醉对丘丘脑下神下神经部分泌物染色部分泌物染色标本不利；股本不利；股动脉放血法有利于脉放血法有利于肠系膜系膜铺片的制作。片的制作。2现在学习的是第2页，共52页 二、二、取材注意事取材注意事项 1 1、材料新鲜、材料新鲜最好是最好是动物心物心脏还在跳在跳动时取材，立即投入固定液内，取材，立即投入固定液内，脏器的器的上皮上皮组织最易最易变质，应争取在死后半小争取在死后半小时内内处理完理完毕。2 2、组织块力求小而薄、组织块力求小而薄 组织块的厚度以不超的厚度以不超过5毫米毫米为宜，宜，较理想的厚度理想的厚度为2毫米左右，毫米左右，主要目的是使固
3、定液迅速而均匀的渗入主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。内部。3 3、勿使组织块受挤压、勿使组织块受挤压 切取切取组织块时刀剪要刀剪要锋利，不要来回挫利，不要来回挫动，夹取取组织时切勿猛切勿猛压，取材，取材时组织块可稍大，以便固定后修可稍大，以便固定后修块。3现在学习的是第3页，共52页 4 4、尽量保持组织的原有形态、尽量保持组织的原有形态新新鲜组织经固定后，或多或少固定后，或多或少产生收生收缩现象，象，为此可将此可将组织展平，展平，以尽可能以尽可能维持原形。持原形。5 5、要熟悉取材部位、要熟悉取材部位 要能准确的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰要能准确的按解剖部位取材，如胰腺，
4、一般取胰岛较多的胰腺尾多的胰腺尾部；肺部；肺应取有取有细支气管及支气管及带有有软骨片的小支气管部。骨片的小支气管部。6 6、动物品种的选择、动物品种的选择 如如观察肥大察肥大细胞，以大、小鼠皮下胞，以大、小鼠皮下组织及及肠系膜、大网膜系膜、大网膜铺片片为佳，欲佳，欲观察运察运动终板，可用小鼠的肋板，可用小鼠的肋间肌等。肌等。4现在学习的是第4页，共52页 7 7、选好组织块的切面、选好组织块的切面熟悉某些器官熟悉某些器官组织成分安排，然后决定其切面的走向；如一成分安排，然后决定其切面的走向；如一长管状管状器官以横切面器官以横切面较好。好。8 8、保持材料的清洁、保持材料的清洁 组织块上如有血液
5、、上如有血液、污物、粘液、食物、物、粘液、食物、粪便等，可用生理便等，可用生理盐水水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。9 9、切除不需要的部分、切除不需要的部分 特特别是是组织周周围的脂肪等，的脂肪等，应尽可能清除掉，否尽可能清除掉，否则给固定、脱固定、脱水、浸蜡、切片等水、浸蜡、切片等带来一些不必要的来一些不必要的问题。5现在学习的是第5页，共52页 三、三、组织固定法固定法 （一）、固定的方法（一）、固定的方法1、小、小块组织固定法固定法：从人体和：从人体和动物取下的小物取下的小块组织，立即置入，立即置入液液态固定固定剂中中进行固定，行固定，这是
6、是应用最广泛最用最广泛最经常的方法。常的方法。2、注射、灌注固定法、注射、灌注固定法：某些：某些组织块由于体由于体积过大或固定液极大或固定液极难渗渗入内部或需要入内部或需要对整个整个脏器或整个器或整个动物物进行固定。行固定。这时宜采用注射宜采用注射固定法，将固定液注入血管，固定法，将固定液注入血管，经血管分支到达整个血管分支到达整个组织和全身，和全身，从而得到充分的固定。从而得到充分的固定。3、蒸汽固定法、蒸汽固定法:比比较细小而薄的小而薄的标本，可用本，可用锇酸或甲酸或甲醛蒸汽固定。主蒸汽固定。主要用于血液或要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜胞涂片以及某些薄膜组织的固定。的固定。6现在学习的是
7、第6页，共52页 （二）、固定的目的（二）、固定的目的1、迅速阻止、迅速阻止组织、细胞的死后胞的死后变化，防止自溶与腐化，防止自溶与腐败，使，使之尽量保持生前的状之尽量保持生前的状态与与结构。构。2、使、使细胞内的蛋白胞内的蛋白质、脂肪、糖、脂肪、糖、酶等成分等成分转变为不溶性不溶性物物质，以保持其原有状，以保持其原有状态。3、使、使组织内各种物内各种物质成分成分产生不同的折光率，以便染色生不同的折光率，以便染色后易于后易于鉴别和和观察。察。7现在学习的是第7页，共52页 4、使、使组织块在脱水、包埋、切片、染色等在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易程中不易损坏。坏。5、使不同、使不同组织成分
8、成分对染料有不同的染料有不同的亲和力，和力，经染色染色处理后易于辨理后易于辨认。6、防止、防止细胞胞过度收度收缩或膨或膨胀而失去其原有形而失去其原有形态结构。构。7、使、使组织块硬化，便于制作薄片。硬化，便于制作薄片。8现在学习的是第8页，共52页 （三）、注意事项及影响固定的因素（三）、注意事项及影响固定的因素1、组织块不易不易过大，一般以厚度大，一般以厚度5mm，长宽不超不超过1515mm。2、固定液的量一般以、固定液的量一般以组织块大小的大小的20倍倍为宜。宜。3、必、必须选择渗透力渗透力强，又不使，又不使组织过渡收渡收缩或膨或膨胀的的试剂作作为固定液。固定液。4、有的固定、有的固定剂是
9、由氧化是由氧化剂与与还原原剂混合而成，如甲混合而成，如甲醛（还原原剂）与重）与重铬酸酸钾（氧化（氧化剂）混合成的）混合成的Helly液等。液等。9现在学习的是第9页，共52页 5、固定、固定时间的的长短短视固定固定剂的不同要求而定，也的不同要求而定，也与气温、与气温、组织块的大小有关。温度高的大小有关。温度高时则时间缩短，短，组织块过大大则应延延长固定固定时间。6、软组织或或较大大组织可先可先经2-3小小时固定后再修整固定后再修整成小成小块重新投入新配制的固定液内重新投入新配制的固定液内继续固定。固定。7、特殊要求的、特殊要求的组织，常需要特殊的固定液，所以，常需要特殊的固定液，所以，取取组织
10、之前之前应做好准做好准备。如各种神。如各种神经组织因因显示内示内容不同，需不同的固定液与固定方法。容不同，需不同的固定液与固定方法。10现在学习的是第10页，共52页 （四）、固定液（四）、固定液1、固定液种、固定液种类：一：一类是是单纯固定液，即只有一种固定液，即只有一种试剂；另一另一类是混合固定液，由两种或两种以上是混合固定液，由两种或两种以上试剂组成。成。作作为较好的固定液，好的固定液，应有下列特性，有下列特性，首先首先，有，有强渗透渗透力，能迅速的渗入力，能迅速的渗入组织内部；内部；其次其次，不使，不使组织过渡收渡收缩或膨或膨胀，并能使，并能使组织内欲内欲观察的成分得以凝固察的成分得以
11、凝固为不不溶性物溶性物质；最后最后，能使，能使组织达到一定的硬度并达到一定的硬度并获得得较佳的佳的折光率和折光率和对某些染料具有某些染料具有较强的的亲和力。和力。11现在学习的是第11页，共52页 2、单纯固定液固定液（1）酒精：）酒精：既是配制混合固定液的基本成分，又可作既是配制混合固定液的基本成分，又可作为单纯固定液使用。用于固定固定液使用。用于固定时以以80%-95%浓度度为好。好。缺点是缺点是经酒精固定的酒精固定的组织容易容易变硬，硬，对组织收收缩较大。大。（2）甲甲醛水溶液水溶液：常用的甲：常用的甲醛水溶液即市售的福水溶液即市售的福尔马林，常用林，常用浓度度为10%，指以，指以10m
12、l的商品甲的商品甲醛（37%-40%甲甲醛水溶液）加入水溶液）加入90ml水配成的，此液水配成的，此液实际上只上只有有4%的甲的甲醛。12现在学习的是第12页，共52页（3）醋酸：）醋酸：亦名乙酸，能与酒精、水、亦名乙酸，能与酒精、水、氯仿等多种仿等多种试剂混混合，故合，故为许多混合固定液成分之一，其穿透速度很快，固多混合固定液成分之一，其穿透速度很快，固定小定小组织仅1h即可，即可，对组织和和细胞有膨胞有膨胀作用，且作用，且不能凝固不能凝固细胞胞质中的蛋白中的蛋白质，一般与引起收，一般与引起收缩的固的固定液一起使用，以达到平衡目的。定液一起使用，以达到平衡目的。（4）苦味酸）苦味酸：苦味酸能
13、沉淀蛋白：苦味酸能沉淀蛋白质，对脂肪、脂肪、类脂无脂无作用，渗透力作用，渗透力较弱，很少弱，很少单独使用，固定后收独使用，固定后收缩明明显，用含苦味酸的固定液固定用含苦味酸的固定液固定组织一般不宜超一般不宜超过24小小时。13现在学习的是第13页，共52页（5）重）重铬酸酸钾：其穿透速度快，其穿透速度快，对组织收收缩小并稍有小并稍有膨膨胀，重，重铬酸酸钾常常备水溶液水溶液为3-5%。其混合固定液，。其混合固定液，如如Zenker液、液、Helly液及液及Regaud液等被广泛用于液等被广泛用于组织学，学，凡凡经重重铬酸酸钾、铬酸、酸、铬酸酸盐固定的固定的组织，必，必须以以流水冲洗后方能流水冲洗
14、后方能转入脱水入脱水剂。（6）锇酸酸：锇酸一般只用于某些特殊染色或酸一般只用于某些特殊染色或电镜切片切片染色或固定，配制染色或固定，配制时要用洗要用洗涤干干净的玻塞棕色瓶，最的玻塞棕色瓶，最好用双蒸水配制，好用双蒸水配制，锇酸穿透力弱，且易使酸穿透力弱，且易使组织硬脆，硬脆，因此它固定的因此它固定的组织必必须小而薄，体小而薄，体积最好在最好在332mm以内。以内。14现在学习的是第14页，共52页（7）铬酸：酸：铬酸能沉淀蛋白酸能沉淀蛋白质，适用于核蛋白的固定，适用于核蛋白的固定，并能增并能增强核的染色能力，穿透速度慢，一般核的染色能力，穿透速度慢，一般组织块的固的固定，需定，需经12-24h
15、，硬化程度中等，收，硬化程度中等，收缩显著，除用著，除用作固定液外，万分之一的作固定液外，万分之一的铬酸水溶液，可制作分离酸水溶液，可制作分离标本。本。（8）丙）丙酮：丙：丙酮能使蛋白能使蛋白质沉淀，渗透力沉淀，渗透力强，但，但对核固定欠佳，且使核固定欠佳，且使组织剧烈收烈收缩。广泛用于。广泛用于组织化化学中学中酶的固定，其作用基本与酒精相同。的固定，其作用基本与酒精相同。（9）三）三氯醋酸醋酸：作用与醋酸相似，很少：作用与醋酸相似，很少单独使用，独使用，在混合固定液中在混合固定液中对组织起膨起膨胀作用。作用。15现在学习的是第15页，共52页 3、常用混合固定液、常用混合固定液（1）Boui
16、n液：液：饱和苦味酸水溶液：和苦味酸水溶液：75ml；甲；甲醛水溶水溶液（液（40%）：）：25ml；冰醋酸：；冰醋酸：5ml。三者在配方中的。三者在配方中的实际比例比例为1：5：15，为实验室常用固定室常用固定剂，其渗，其渗透力透力强，对组织固定均匀且收固定均匀且收缩较小，染色效果小，染色效果好。冰醋酸固定染色好。冰醋酸固定染色质，苦味酸使，苦味酸使组织适当硬化，适当硬化，甲甲醛水溶液水溶液调节两种两种试剂对组织的膨的膨胀作用。其作用。其固定固定时间以以12-24h为宜。宜。16现在学习的是第16页，共52页（2）Carnoy液液：冰冰醋醋酸酸一一份份，氯仿仿三三份份，无无水水酒酒精精六六份
17、份。此此液液浸浸透透速速度度快快，固固定定时间不不宜宜过长，小小块组织2-3小小时即即可可，固固定定后后直直接接入入无无水水酒酒精精脱脱水水。常常用用于于糖糖原原及及尼尼氏氏体体固固定定。一一般般固固定定时须放放在在冰冰箱箱中中，低低温温环境境可可明明显减少收减少收缩作用。作用。（3）中中性性甲甲醛液液：最最常常用用的的固固定定液液之之一一，配配方方:40%甲甲醛120ml,蒸蒸馏水水880ml，磷磷酸酸二二氢钠4g，磷磷酸酸氢二二钠13g，pH7.0。（4）中中性性缓冲冲甲甲醛液液：为免免疫疫组织化化学学最最常常用用的的固固定定液液。固固 定定 时 间24h为 宜宜，配配 方方：40%甲甲
18、醛 10ml，0.01mol/LpH7.4的的PBS90ml17现在学习的是第17页，共52页第二章：固定后处理及切片第二章：固定后处理及切片 一、一、洗洗涤与修切与修切 1 1、水洗法、水洗法一般常用流水冲洗，凡用含一般常用流水冲洗，凡用含铬或或锇的固定液固定的的固定液固定的组织块，必，必须用流水用流水冲洗冲洗24h左右。常用的固定液左右。常用的固定液为10%的甲的甲醛水溶液，也必水溶液，也必须用流水用流水冲洗，一般冲洗，一般时间也也为24h左右，固定左右，固定时间长的的标本，冲洗本，冲洗时间也也应延延长。2 2、酒精洗涤法、酒精洗涤法 凡含苦味酸或酒精的固定液固定的凡含苦味酸或酒精的固定液
19、固定的组织块，大多采用酒精洗，大多采用酒精洗涤，如，如苦味酸影响着色，但易溶于苦味酸影响着色，但易溶于70%酒精。酒精。18现在学习的是第18页，共52页 二、二、取材注意事取材注意事项 1 1、材料新鲜、材料新鲜最好是最好是动物心物心脏还在跳在跳动时取材，立即投入固定液内，取材，立即投入固定液内，脏器的器的上皮上皮组织最易最易变质，应争取在死后半小争取在死后半小时内内处理完理完毕。2 2、组织块力求小而薄、组织块力求小而薄 组织块的厚度以不超的厚度以不超过5毫米毫米为宜，宜，较理想的厚度理想的厚度为2毫米左右，毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织
20、块内部。内部。3 3、勿使组织块受挤压、勿使组织块受挤压 切取切取组织块时刀剪要刀剪要锋利，不要来回挫利，不要来回挫动，夹取取组织时切勿猛切勿猛压，取材，取材时组织块可稍大，以便固定后修可稍大，以便固定后修块。19现在学习的是第19页，共52页 三、三、脱水与透明脱水与透明 （一）、脱水的意义与目的（一）、脱水的意义与目的组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前，必混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水，脱水是行脱水，脱水是借某些溶媒置借某些溶媒置换组织内水分的内水分的过程。脱水程。脱水时必必须由低由低浓度脱水度脱水剂开始，逐步开始
21、，逐步转入高入高浓度脱水度脱水剂，以防，以防组织过度收度收缩而而变形，或脱水不完全而影响制片效果。脱形，或脱水不完全而影响制片效果。脱水水剂必必须具有下列特性具有下列特性:脱水脱水剂能与水按比例混合；高能与水按比例混合；高浓度，一般指不含水分；脱水度，一般指不含水分；脱水剂也能与透明也能与透明剂混合。混合。20现在学习的是第20页，共52页 1、脱水、脱水剂（1）酒精：）酒精：是最常用的脱水是最常用的脱水剂，脱水能力，脱水能力强，并能，并能使使组织硬化。其主要缺点是易使硬化。其主要缺点是易使组织收收缩、变脆，脆，故故应勿直接用高勿直接用高浓度酒精，一般从度酒精，一般从70%酒精开始；酒精开始；
22、脱水脱水时间勿勿过长。在。在70%可可长时间保存。保存。（2）丙丙酮：脱水作用比酒精：脱水作用比酒精强，但，但对组织块的收的收缩较大，大，价格价格较高，主要用于快速脱水或固定兼脱水，脱水高，主要用于快速脱水或固定兼脱水，脱水时间一般一般为1-3h左右。左右。21现在学习的是第21页，共52页（3）正丁醇和叔丁醇：）正丁醇和叔丁醇：正丁醇是无色液体，脱水能力正丁醇是无色液体，脱水能力较弱，可和水、酒精和石蜡互溶，因此弱，可和水、酒精和石蜡互溶，因此这种脱水的种脱水的组织块可直接浸蜡和包埋。叔丁醇是目前常用的一可直接浸蜡和包埋。叔丁醇是目前常用的一种脱水种脱水剂，它不易使，它不易使组织收收缩或或变
23、硬，且脱水后不硬，且脱水后不经透明直接浸蜡，透明直接浸蜡，电镜标本制作本制作时常用作中常用作中间脱水脱水剂。（4）其余脱水其余脱水剂：还可以用作脱水可以用作脱水剂的有：异丙醇、的有：异丙醇、还氧己氧己烷、四、四氢呋喃、喃、环己己酮和松脂醇等，但由于某些和松脂醇等，但由于某些原因，原因，现在都不常用。在都不常用。22现在学习的是第22页，共52页 2、透明或媒浸、透明或媒浸（1）二甲苯：）二甲苯：是最常用的常是最常用的常规透明透明剂，它，它对组织的的收收缩性性强，易使，易使组织变硬硬变脆，在二甲苯中一般脆，在二甲苯中一般30min即可使即可使组织透明，透明，组织块可先可先经过无水酒精无水酒精-二
24、甲苯混合液二甲苯混合液处理，再浸入二甲苯。也常用于切片染色理，再浸入二甲苯。也常用于切片染色后透明，且不会使染料退色。后透明，且不会使染料退色。（2）苯和甲苯苯和甲苯：对组织收收缩性性较小，与二甲苯相比不易小，与二甲苯相比不易使使组织变脆，但透明速度慢且脆，但透明速度慢且挥发快，适用于快，适用于处理致密理致密结缔组织、肌肉及腺体等、肌肉及腺体等组织的透明。的透明。23现在学习的是第23页，共52页（3）氯仿：仿：不易使不易使组织变硬硬变脆，但透明能力比二甲脆，但透明能力比二甲苯差，用作透明苯差，用作透明剂时，多用于大，多用于大块组织的透明的透明（1cm），而且在容器内放置无水硫酸），而且在容器
25、内放置无水硫酸铜。（4）其他透明）其他透明剂：四：四氯化碳、苯甲酸甲化碳、苯甲酸甲酯和水和水杨酸甲酸甲酯、香柏油（皮肤、子、香柏油（皮肤、子宫、肌肉和肌腱）、松油醇、肌肉和肌腱）、松油醇、丁香油、冬青油与苯胺油和火棉胶包埋的媒浸液等。丁香油、冬青油与苯胺油和火棉胶包埋的媒浸液等。24现在学习的是第24页，共52页 3、浸蜡、浸蜡组织经透明后，在溶化的石蜡内浸透明后，在溶化的石蜡内浸渍的的过程称浸蜡。程称浸蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56，在夏天，在夏天较热时一一般用高熔点石蜡，在冬天气温般用高熔点石蜡，在冬天气温较低低时用低熔点石蜡，用低熔点石蜡，主要是有利于切片的
26、制作。主要是有利于切片的制作。时间不易不易过长，否，否则容易容易造成造成组织脆硬，脆硬，时间不足，也不足，也难制作良好的切片。制作良好的切片。25现在学习的是第25页，共52页 四、四、组织的包埋与包埋方法的包埋与包埋方法组织块经过浸透浸透剂浸透后，再用包埋浸透后，再用包埋剂（石蜡、火（石蜡、火棉胶、碳蜡和棉胶、碳蜡和树脂等）包起的脂等）包起的过程称包埋。不同的包埋程称包埋。不同的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成方法有不同的要求，包埋后均可制成组织的的块。经过包包埋后，可使埋后，可使组织达到一定的硬度和达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄度，有利于切成薄片。片。26现在学习的是第26页，共5
27、2页 （一）、石蜡包埋法（一）、石蜡包埋法 石石蜡蜡包包埋埋法法为组织学学技技术中中最最常常用用的的一一种种包包埋埋法法。石石蜡蜡具具有有不不同同的的熔熔点点，夏夏天天一一般般用用50以以上上熔熔点点（硬硬蜡蜡）石石蜡蜡包包埋埋，冬冬天天用用50以以下下熔熔点点（软蜡蜡）石石蜡蜡包包埋埋，软的的组织用用软蜡蜡包包埋埋，硬硬的的组织用用硬硬蜡蜡包包埋埋，一一般般常常用用的的包包埋埋熔熔点点使使52-56，如如果果需需要要切切4微微米米以以下下的的切切片片，则用用56-60 的的石石蜡蜡，较厚厚的的切切片片则用用熔熔点点为52-54的的石石蜡蜡。新新蜡蜡必必须在在温温箱箱内内溶溶化化一一次次，以以
28、使使其其所所含含的的挥发性物性物质蒸蒸发，无，无论新蜡和旧蜡都必新蜡和旧蜡都必须加加热过滤后再包埋。后再包埋。27现在学习的是第27页，共52页 （二）、石蜡包埋法包埋过程（二）、石蜡包埋法包埋过程 组织块透透明明后后，即即可可放放入入已已熔熔的的石石蜡蜡内内浸浸蜡蜡；一一般般厚厚度度约5mm的的实质性性器器官官，总的的浸浸蜡蜡时间约2-3h，均均在在恒恒温温箱箱内内进行行。较理理想想的的的的浸浸蜡蜡温温度度是是石石蜡蜡刚溶溶化化的的温温度度，或或在在蜡蜡杯杯底底部部尚尚残残留留一一小小部部分分未未熔熔完完蜡蜡时的的温温度度，浸浸蜡蜡完完成成后后，即即做做成成包包有有组织的的蜡蜡块。包包埋埋蜡
29、蜡块的的器器材材有有专用用的的包包埋埋框框，也也有有自自己己制制作作的的包包埋埋盒盒，只只要要是是具具有有一一定定形形状状的的容容器器，我我们都可以把它用作包埋盒。都可以把它用作包埋盒。包埋的具体包埋的具体过程程详述。述。28现在学习的是第28页，共52页 （三）、其他包埋法（三）、其他包埋法 除除上上述述常常用用包包埋埋法法以以外外，还有有其其他他一一些些包包埋埋方方法法，如如塑塑料料包包埋埋法法、碳碳蜡蜡包包埋埋法法、明明胶胶包包埋埋法法、松松脂脂醇醇包包埋埋法法、甲甲基基丙丙烯酸酸甲甲酯包包埋埋法法、双双重重包包埋埋法法及及二二甲甲氧氧基基丙丙烷石石蜡蜡包埋法等。包埋法等。29现在学习的
30、是第29页，共52页 （五）、火棉胶包埋法（五）、火棉胶包埋法 火火棉棉胶胶常常用用于于大大块组织的的包包埋埋。课避避免免纤维组织和和肌肌肉肉组织的的过度度硬硬化化，减减少少纤维组织的的收收缩和和扭扭转，利利于保持原有的于保持原有的组织结构。构。（六）、树脂包埋法（六）、树脂包埋法 树脂脂包包埋埋法法适适用用于于不不脱脱钙骨骨髓髓活活检组织，肝肝、肾穿穿刺刺活活检和和淋淋巴巴组织等等，可可观察察细胞胞的的细微微结构构。树脂脂选用用亲水水性性甲甲基基丙丙烯酸酸-2-羟基基乙乙基基酯，组织不不需需脱脱水水，对细胞形胞形态影响影响轻。30现在学习的是第30页，共52页 五、五、切片切片石蜡切片是以石
31、蜡作石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介制作切片的。的支持媒介制作切片的。切片前的切片前的处理：理：A:修切蜡修切蜡块：切片前切片前应先修先修块，即切去，即切去组织周周围过多的石蜡，一般留下至少多的石蜡，一般留下至少约2mm宽度的蜡度的蜡边为宜。注意宜。注意蜡蜡块不能留得太窄，在切片不能留得太窄，在切片时易易损坏坏组织；蜡；蜡边不能留不能留得太多，否得太多，否则影响展片。影响展片。室温室温过高高时，可将修好的蜡，可将修好的蜡块放放到冰箱中冷却一定到冰箱中冷却一定时间。31现在学习的是第31页，共52页 B:切片用品准切片用品准备（1）切片刀：）切片刀：预先磨好切片刀先磨好切片刀备用或切片前更用或
32、切片前更换 新的一新的一次性切片，切片刀次性切片，切片刀对组织块的的倾角非常重要，一般在角非常重要，一般在10以内，以内，过小小则组织块不能先与刀刃的刀口接触，不能先与刀刃的刀口接触，过大大时，使刀口刮使刀口刮组织蜡蜡块表面，切片易碎。表面，切片易碎。（2）载物片：物片：载物片物片经清清洁液、液、95%乙醇乙醇处理后理后备用。用。（3）展片）展片仪：加入温水，接通：加入温水，接通电源，源，调整温度整温度（4）其他用品：准）其他用品：准备好毛笔、好毛笔、记号笔、号笔、镊子、等。子、等。32现在学习的是第32页，共52页 六、六、粘片粘片粘片的目的是将石蜡切片粘附在粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻
33、片上，借水玻片上，借水的的张力和一定的温度，使略力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，以便的蜡片伸展平整，以便染色和染色和镜检。粘片有两种方式：粘片有两种方式：水水捞法法将一个盛水的容器加将一个盛水的容器加热至至35-40，将蜡，将蜡带光光泽面向下面向下铺于温水上，待蜡片伸展于温水上，待蜡片伸展平整后，即可用平整后，即可用长镊子分离每一个蜡片，再用子分离每一个蜡片，再用载玻片玻片伸入水中，从蜡片下面伸入水中，从蜡片下面捞起，直立玻片使水流掉并置起，直立玻片使水流掉并置温箱内烘干。温箱内烘干。33现在学习的是第33页，共52页 干粘法干粘法可将已可将已经切离的蜡片切离的蜡片单个的放在加有数滴个的
34、放在加有数滴蒸蒸馏水的水的载玻片上，然后在酒精灯上玻片上，然后在酒精灯上摇晃烘烤，此晃烘烤，此时应注意控制水的温度勿使注意控制水的温度勿使过高，待蜡片平整后，高，待蜡片平整后，倾去去玻片上的水，用玻片上的水，用细针调正蜡片的位置，正蜡片的位置，继续在酒精灯在酒精灯上烘烤至蜡片呈半透明状上烘烤至蜡片呈半透明状为止，以后在温箱内烘干即止，以后在温箱内烘干即可。当蜡片已放在有水的可。当蜡片已放在有水的载玻片上后，可不玻片上后，可不经酒精灯酒精灯烘烤，而在烘烤，而在调好温度的好温度的电热板上烘烤。板上烘烤。34现在学习的是第34页，共52页第三章：染料、常用染液及常第三章：染料、常用染液及常规苏木素规
35、苏木素-伊红染色法伊红染色法 一、一、染料性染料性质 染料：含有染料：含有发色色团的有机化合物的有机化合物盐类物物质溶解于水并具有溶解于水并具有电荷荷组织着色着色碱性染料：具有阳碱性染料：具有阳电荷。含氨基（荷。含氨基（-NH2)、二甲氨基二甲氨基-N(CH3)2 等碱性助色等碱性助色团。酸性染料：具有阴酸性染料：具有阴电荷。含荷。含羧基（基（-OOH）、）、羟基（基（-OH）或磺基（）或磺基（-SO3H）等酸性助色等酸性助色团。35现在学习的是第35页，共52页 二、染色原理二、染色原理：嗜嗜碱碱性性：细胞胞和和组织中中的的酸酸性性物物质或或结构构（嗜嗜碱碱性性物物质）与碱性染料与碱性染料亲
36、和力和力强。嗜嗜酸酸性性：细胞胞和和组织中中的的碱碱性性物物质或或结构构（嗜嗜酸酸性性物物质）与酸性染料与酸性染料亲和力和力强。中性：中性：与两种染料的与两种染料的亲和力均不和力均不强。在在组织染染色色中中所所谓的的“嗜嗜酸酸性性”及及“嗜嗜碱碱性性”一一词，是是说该物物质易易被被酸酸性性或或碱碱性性染染料料所所染染，而而细胞胞本本身身的的酸性或碱性正与其相反。酸性或碱性正与其相反。36现在学习的是第36页，共52页 三、常用染液及染色法三、常用染液及染色法：1、细胞核常用染色法胞核常用染色法 A：苏木木精精-苏木木精精是是从从苏木木用用乙乙醚连续提提取取的的淡淡黄黄色色或或棕棕黄黄色色结晶晶
37、，溶溶于于酒酒精精，甘甘油油及及热水水中中。苏木木精精不不能能单独独使使用用，主主要要是是对组织的的亲和和力力小小，欲欲使使其其成成为一一种种染染料料，必必须在在苏木木精精溶溶液液中中加加入入复复盐和和氧氧化化剂。配配制制苏木木精精的的常常用用氧氧化化剂有有过锰酸酸钾、氧氧化化汞汞、碘碘酸酸钠及及过氧氧化化氢等等，或或将将配配置置好好的的苏木木精精在在空空气气中中自自然然氧氧化化，所所以以放放置置时间较长的的苏木精染液染色效果木精染液染色效果较好。好。37现在学习的是第37页，共52页 B：硫硫堇或或甲甲苯苯胺胺蓝染染色色法法-切切片片入入1%硫硫堇或或甲甲苯苯胺胺蓝水水溶溶液液染染12-24
38、h，然然后后95%酒酒精精分分色色，结果果：核核蓝色色，粘粘液，液，软骨基骨基质，肥大，肥大细胞胞颗粒呈粒呈蓝紫色。紫色。C：碱碱性性品品红-碱碱性性品品红对显示示多多数数糖糖类及及弹性性纤维效效果果良良好好，也也可可显示示核核酸酸。作作为细胞胞核核的的一一般般染染色色，可可用用0.5-1%水溶液染色数分水溶液染色数分钟。D：媒媒染染染染料料细胞胞核核染染色色法法-指指在在配配制制染染料料时需需加加入入一一些些媒媒染染剂如如氯化化铝，铝矾等等类似似的的复复盐才才易易着着色色。如如天天青青石石蓝B染染色色法法：天天青青石石蓝B0.1克克，铁矾5克克，蒸蒸馏水水100ml，混混合合后后煮煮沸沸数数
39、分分钟，冷冷后后过滤，切切片片染染2-3分分钟，此液可代替此液可代替苏木精染木精染细胞核。胞核。38现在学习的是第38页，共52页 2、细胞胞质常用染色法常用染色法 A：伊伊红-伊伊红种种类很很多多，但但常常用用为伊伊红B和和伊伊红Y。同同时一一般般均均配配成成0.5-1%水水溶溶液液或或酒酒精精溶溶液液，在在染染蓝色色核核后后，经伊伊红复染，最后用复染，最后用95%酒精分色酒精分色。B：酸酸性性品品红-酸酸性性品品红常常用用于于结缔组织染染色色，染染色色后后色色泽鲜艳，缺点是易于退色，不易，缺点是易于退色，不易长久保持。久保持。C：藻：藻红-使用法与伊使用法与伊红相同。相同。D：焰：焰红-使
40、用法与伊使用法与伊红相同。相同。39现在学习的是第39页，共52页 四、四、苏木精木精-伊伊红染色法染色法：为最最常常用用及及最最普普通通的的染染色色方方法法。一一般般观察察的的组织切片都用本法染色。切片都用本法染色。简称：称：HE染色。染色。苏木精苏木精伊伊 红红嗜碱性结构：嗜碱性结构：细胞核粗面内质网游离核糖体等嗜酸性结构：嗜酸性结构：细胞质基质溶酶体、线粒体等细胞器胶原纤维等40现在学习的是第40页，共52页 五、染色后透明封片五、染色后透明封片：经过HE染染色色后后，通通过各各梯梯度度酒酒精精后后进入入二二甲甲苯苯溶溶液液，其其主主要要作作用用是是透透明明组织，透透明明后后在在组织块处
41、滴滴上上树胶胶后后用用盖玻片分片，自然干燥后即可在盖玻片分片，自然干燥后即可在显微微镜下下观察。察。41现在学习的是第41页，共52页石蜡切片法石蜡切片法组织经石蜡包埋后制成的蜡石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的，用切片机制成切片的过程称程称为石蜡切片法。一般切石蜡切片法。一般切5-8微米的厚度，要微米的厚度，要观察病察病变的的连续性可制作性可制作连续切片。除此之外，石蜡包埋的切片。除此之外，石蜡包埋的组织块便于便于长期保存，因此，石蜡切片仍是目前各种切片期保存，因此，石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用，最普遍的一种方法。制作方法中最常用，最普遍的一种方法。第四章：石蜡切片法制作过
42、程第四章：石蜡切片法制作过程42现在学习的是第42页，共52页 切片法主要步骤切片法主要步骤 1 1、取材与固定、取材与固定（1）取材：）取材：从从动物体取下所需的器官材料。取材的物体取下所需的器官材料。取材的动物物要健康，材料愈新要健康，材料愈新鲜愈好，愈好，应在致死后立即取材，防止在致死后立即取材，防止组织细胞自溶胞自溶变性；取材的器械要性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄利；所取材料力求小而薄（以不超（以不超过0.5cm为宜），不能宜），不能挤压和和损伤。43现在学习的是第43页，共52页 （2）固固定定：将将所所取取的的材材料料立立即即投投入入固固定定液液中中，目目的的是是使使组织
43、蛋蛋白白迅迅速速凝凝固固，使使细胞胞内内的的结构构和和成成分分不不再再发生生变化化，保保持持组织细胞胞与与活活体体相相似似的的形形态结构构，固固定定后后的的组织块变硬硬，便便于于进一一步步处理理。常常用用的的固固定定剂有有甲甲醛、乙乙醇醇、苦苦味味酸酸或或混混合合固固定定液液。实验室室常常用用Bouin固固定定液液，固固定定时间为1224小小时，其其固固定定的的组织块不需不需进行水洗，可直接行水洗，可直接进行脱水。行脱水。44现在学习的是第44页，共52页 2 2、脱水与透明、脱水与透明（1）脱脱水水：固固定定后后的的组织块内内含含有有的的大大量量水水分分要要彻底底脱脱去去，以以便便石石蜡蜡的
44、的浸浸入入。常常用用的的脱脱水水剂为乙乙醇醇，脱脱水水过程程必必须循循序序渐进，从从低低浓度度开开始始，逐逐步步升升高高，使使组织块中中的的水水分分逐逐渐被被乙乙醇醇所所取取代代。具具体体操操作作为：Bouin固固定定液液固固定定的的组织块可可直直接接进入入70的的乙乙醇醇进行行脱脱水水，时间12小小时左左右右。（若若材材料料暂不不制制片片，可可保保存存于于70乙乙醇醇中中。）然然后后将将组织块依依次次移移入入85乙乙醇醇（）、（）各各8-12小小时，95乙乙醇醇（）、（）各各2小小时，100乙乙醇醇（）、（）各各1小小时。因因无无水水乙乙醇醇对组织有有脆脆化化作作用用，故故在无水乙醇中在无水
45、乙醇中时间不能超不能超过2小小时。45现在学习的是第45页，共52页 （2）透透明明：由由于于乙乙醇醇与与石石蜡蜡不不能能相相溶溶，故故浸浸蜡蜡前前要要对脱脱水水后后的的组织块进行行透透明明。常常用用透透明明剂有有二二甲甲苯苯、氯仿仿、苯苯、香香柏柏油油或或冬冬青青油油等等，透透明明剂能能同同与与乙乙醇醇和和石石蜡蜡相相溶溶，并并能能增增强组织块的的折折光光系系数数，故故透透明明后后的的组织块呈呈半半透透明明状状。使使用用二二甲甲苯苯作作透透明明剂的的透透明明过程程为：将将脱脱水水后后的的组织块放放入入无无水水乙乙醇醇与与二二甲甲苯苯混混合合液液（1:1）中中30分分钟，再移入二甲苯中再移入二
46、甲苯中15-20分分钟。46现在学习的是第46页，共52页 3、浸蜡与包埋、浸蜡与包埋 （1）浸蜡：将透明后的）浸蜡：将透明后的组织块置于置于刚过熔点的熔化石蜡中熔点的熔化石蜡中浸浸渍，使石蜡逐，使石蜡逐渐渗入并完全置渗入并完全置换出透明出透明剂。过程程为：先将：先将透明的透明的组织块移入二甲苯与石蜡混合液（移入二甲苯与石蜡混合液（1:1）中，在）中，在60温箱中放置温箱中放置30分分钟，再移入熔化的石蜡（，再移入熔化的石蜡（）、（）、（）、）、（）中，在温箱中每）中，在温箱中每级各各1小小时。（2）包埋：将浸蜡后的）包埋：将浸蜡后的组织块置于盛有熔化石蜡的模具置于盛有熔化石蜡的模具中，并使之
47、凝固成蜡中，并使之凝固成蜡块。47现在学习的是第47页，共52页 4、切片与贴片、切片与贴片 （1）切切片片：将将修修整整后后的的蜡蜡块夹在在切切片片机机的的固固定定器器内内，使使蜡蜡块的的被被切切面面与与刀刀口口平平行行，刀刀和和蜡蜡块成成一一斜斜角角，以以右右手手摇动摇柄柄进行行切切片片，切切片片厚厚度度以以58um为宜宜，连续操操作作可可形形成成蜡蜡带，此，此时左手持毛笔左手持毛笔轻轻取下蜡取下蜡带，放于盒中。，放于盒中。（2）展展片片：将将切切下下的的蜡蜡片片放放于于温温水水（约40）的的表表面面，使使皱褶自然舒展开来。褶自然舒展开来。（3）贴片片：借借助助分分离离针或或镊子子，将将蜡
48、蜡片片贴在在洁净载玻玻片片上上。贴片片后后，将将切切片片置置于于切切片片架架上上自自然然干干燥燥或或放放入入温箱（温箱（40左右）中烘干。左右）中烘干。48现在学习的是第48页，共52页 5、染色与封固、染色与封固 （1）染色：）染色：染色后可增加染色后可增加细胞和胞和组织中各中各结构构间色彩色彩的的对比以便于比以便于观察。切片的染色方法很多，常用的是察。切片的染色方法很多，常用的是苏木精（木精（hematoxylin）伊伊红(eosin)染色，染色，简称称HE染染色。染色的具体步色。染色的具体步骤如下：如下：脱蜡：将切片放入二甲苯（脱蜡：将切片放入二甲苯（）、（）、（）中，各置）中，各置51
49、0分分钟，溶去切片上的石蜡。，溶去切片上的石蜡。49现在学习的是第49页，共52页 滋养滋养层 将将脱脱蜡蜡的的切切片片经各各级浓度度乙乙醇醇（由由高高到到低低）下下行行至至水水：将将从从二二甲甲苯苯（）中中取取出出的的切切片片依依次次经过：二二甲甲苯苯与与无无水水乙乙醇醇混混合合液液（1:1）无无水水乙乙醇醇（）无无水水乙乙醇醇（）95%乙乙醇醇85乙乙醇醇70乙乙醇醇各各35分分钟，最后在蒸，最后在蒸馏水中浸水中浸5分分钟，即可，即可进行染色。行染色。切切片片由由蒸蒸馏水水中中转入入苏木木精精染染液液染染色色510分分钟，使使细胞内的嗜碱性物胞内的嗜碱性物质着色。着色。50现在学习的是第5
50、0页，共52页 用自来水洗去切片上残余的染液。用自来水洗去切片上残余的染液。0.51盐酸溶液分色数十秒酸溶液分色数十秒钟。放入自来水中放入自来水中1520分分钟、蓝化。化。置入置入70、85乙醇中各乙醇中各35分分钟。置置入入伊伊红染染液液中中染染色色12分分钟，使使细胞胞中中嗜嗜酸酸性性 物物质着色。着色。依依次次进入入95乙乙醇醇（）、（）100乙乙醇醇（）、（）、（），各），各5分分钟，以除去切片上水份。，以除去切片上水份。透透明明：切切片片入入无无水水乙乙醇醇与与二二甲甲苯苯混混合合液液（1:1）二二甲苯（甲苯（）、（）、（）（）（），各），各5分分钟。51现在学习的是第51页，共52