哺乳动物细胞克隆.pptx

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1、本章主要内容本章主要内容 动物克隆技术发展简史与意义 克隆“多莉”羊的具体操作过程“多莉”羊独特点及成功的根本原因 克隆人胚胎引发争议 克隆技术未来的发展 体细胞克隆动物胚胎分割法细胞核移植技术的原理与方法8.2产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法简史、克隆动物研究意义第1页/共67页克隆定克隆定义义克隆(clone)的音译，原意指用于扦插的枝条，也即无性繁殖。1963年Haldane最先使用“clone”,至世纪7080年代，克隆一词开始广泛使用。遗传学定义的“克隆”:指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体，通过无性繁殖而形成的群体。在不发生突变的情况下，它们具有相同的遗传结构

2、。“克隆”分为分子克隆、细胞克隆和个体克隆三个层面。第2页/共67页在分子层次上在分子层次上，-“分子克隆分子克隆”。将。将DNADNA片片段插到一个载体中，在宿主细胞中自我复制。段插到一个载体中，在宿主细胞中自我复制。在细胞层次上在细胞层次上，-单克隆抗体单克隆抗体。指由一个单。指由一个单一的共同祖先细胞所形成的一个细胞一的共同祖先细胞所形成的一个细胞“群体群体”。在个体层次上在个体层次上，克隆克隆是指基因型完全相同的是指基因型完全相同的2 2个或更多个体组成一个个或更多个体组成一个“群体群体”。19971997年，世界卫生组织（年，世界卫生组织（WHOWHO）解释克隆：）解释克隆：克隆为遗

3、传上同一的机体或细胞系（株）的克隆为遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性繁殖无性繁殖。第3页/共67页 动物克隆技术发展简史与动物克隆技术发展简史与意义意义8.1.1 简史 由“胚胎分割”开始。1978年，建立了卵裂球分离和桑葚胚分离技术。之后对胚胎分割程序简化和提高胚胎分割效率研究；现已发展到不依赖于显微操作，而在实体显微镜下操作的胚胎分割。在胚胎分割基础上，开始“细胞核移植”研究。“细胞核移植”才是技术含量最高的动物克隆。第4页/共67页1938年，Spemann提出以核移植生产克隆动物的设想开始，1952年，产生了世界上第一种克隆动物非洲豹蛙；1963年，我国胚胎学家于克隆出亚洲鲤鱼；1

4、997年Wilmut等利用成体细胞核移植技术获得克隆绵羊“Dolly”，在动物克隆研究领域取得了重大突破。迄今为止，动物克隆在各国如火如荼，成功克隆的动物有20余种，包括鱼、羊(绵、山羊)、老鼠、猫、狗、牛、马、兔子、骡子、猪、狼、猕猴等。动物克隆的里程碑事件：第5页/共67页20余种克隆动物大盘点1 鲤鱼 童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中从而成功克隆了一只雌性鲤鱼。2 克隆羊 1996年7月5日，世界上第一头由成年羊体细胞经过无性繁殖生成的克隆羊多莉诞生 第6页/共67页3、克隆老鼠Cumulina 1997年，夏威夷科学家从成年小老鼠的细胞复制出第一只克

5、隆小老鼠，名叫Cumulina。4、克隆奶牛 日本石川县家畜研究中心在世界上率先从体细胞复制牛，首两头克隆牛分别名为“KAGA-号”和“NOTO一号”第7页/共67页5、克隆山羊 世界上第一批三只克隆山羊已由美国一家生物公司于1998 年“制造”出来。克隆山羊Mira和她的姐妹们都来自美国的实验室，它们生产含有人类抗凝血酶-3（antithrombin lll）的羊奶。6、首个克隆猪 英国产生克隆绵羊“多莉”的公司，在美国的分部成功地产生了5头克隆猪。第8页/共67页图图8-58-5耳上皮细胞克隆羊耳上皮细胞克隆羊”阳阳阳阳”左和其原左和其原型型”青青青青”出自：西北农林科技大学张涌等，200

6、0.6.22图8-6“阳阳”5岁生日及其后代，四世同堂，当上太姥姥证明了第一代克隆羊及其后代都具有正常的生育能力.第9页/共67页7、克隆摩弗伦羊 摩弗伦羊（又称欧洲盘羊）是一种濒危物种，全世界所存野生盘羊不足一千只，2000年，科学家从两头分别死亡将近18小时和24小时的雌盘羊卵巢内取出DNA，将其注入盘羊的“近亲”普通白羊的去核卵细胞内，155天后正常的产下一只小盘羊。首次把克隆技术应用于一种濒临灭绝的哺乳类动物身上。8、克隆猕猴 2000年1月，一只克隆猕猴在美国俄勒冈地区灵长类动物研究中心呱呱坠地。这是全世界第一次成功地克隆灵长类动物在基因上与人类最接近的动物。第10页/共67页9、克

7、隆野牛 2001年1月8日，这只名叫“诺亚”的印度野牛（濒危野生动物）在美国爱荷华州诞生，体重80磅。只活了一天。10、克隆兔 2001年，体细胞克隆兔诞生。第11页/共67页出自：山东莱阳农学院教授 董亚娟，柏学进等，2001.12 第12页/共67页美科学家进行商业猫克隆售价5万美元的克隆猫小尼基和它的主人Opening the way to replicating pets and other valued animals11、克隆猫CC 美国得克萨斯农工大学于2001年培育的第一只克隆猫CC。第13页/共67页12、克隆老鼠“拉尔夫”大老鼠难以复制，2002年复制的名为“拉尔夫（Ral

8、ph）”的老鼠是第一只。13、克隆骡子 2003年5月5日，一头名为“Idaho Gem”的骡子在母驴子宫中经过346天的正常妊娠期后降生。第14页/共67页克隆骡子：“爱达荷宝石”2003年5月29日,美国科学家宣布克隆了一头骡子，为世界范围内第一次克隆出马科动物，也是克隆杂种动物的首次成功尝试。方法方法：从骡子胚胎细胞核内提取DNA（脱氧核糖核酸），将其与去核的马卵母细胞细胞结合.形成杂种胚胎。该成果意义该成果意义:首先首先,有助于克隆其他自身繁殖有困难的濒危动物;其次其次,对研究癌症等疾病有重要的参考价值。一些癌症患者细胞内CaCa2+2+含量异常高。而马科动物细胞内的钙含量比人低,已识

9、别出其细胞中含有一种化学物质,能够抑制细胞内钙含量增高。第15页/共67页克隆骡克隆骡“爱达荷宝石爱达荷宝石”2004年在西雅图展出的三匹克隆骡子年在西雅图展出的三匹克隆骡子两头“出身竞赛名门”的克隆骡子兄弟于2006年6月参加了美国西部地区举行的一次“专业赛跑比赛”，结果它们最终仅仅在有八名“参赛选骡”参加的短距离跑步项目中名列第三和第七名。-为美国的癌症研究活动筹集更科研经费。-海外博览 2006年06月06日 第16页/共67页14、克隆马 意大利克雷莫纳的再生技术实验室的研究人员于2003年5月底克隆出了第一只驮马，这意味着马也加入了猫、山羊、母牛、兔子以及绵羊等被人类克隆过的动物行列

10、。15、克隆非洲野猫 2003年8月6号，奥特朋濒危动物研究中心的研究人员通过单体克隆技术首次成功克隆出一只非洲野猫。第17页/共67页16、克隆鹿 2003年5月23日，美国德州农业机械大学克隆出世界第一只白尾鹿，名字叫“杜威（Dewey）”。从一头死去的白尾雄鹿皮肤样本的成纤维细胞作核供体.17、克隆雪貂 2004年，就职于美国依阿华大学的李子义教授成功培育出了世界首批“克隆雪貂”，第18页/共67页18、克隆水牛 印度克隆出的世界上的首头水牛已经死于肺部感染。19、克隆狗 2005年，韩国汉城国立大学兽医学院的科学家率先在世界上首次成功进行了狗的克隆。第19页/共67页20、克隆狼 首尔

11、大学教授李柄千和申南植领导的研究小组于2005年10月18日和26日先后获得了两头体重分别为430克和530克的雌性克隆狼。两只克隆狼的名字分别为Snuwolf和Snuwolfy。被克隆的灰狼是韩国环境部指定的1级野生保护动物。第20页/共67页治治疗疗性性克克隆隆 动物模型动物模型器官移植器官移植濒濒危危动动物物转基因动物乳腺生物反应器转基因动物乳腺生物反应器基础研究基础研究遗传育种遗传育种 克克 隆隆（2 2）克隆动物研究意义）克隆动物研究意义第21页/共67页8.2 8.2 产生遗传相同个体产生遗传相同个体(克隆）的原理与方克隆）的原理与方法法胚胎分割胚胎分割细胞核移植细胞核移植（包括连

12、续细胞核移植（包括连续细胞核移植或继代核移植或重复克隆）。以奶牛为例，产生相同遗传个体的方法有五种：胚胎分割；胚胎细胞；胚胎干细胞；胎儿成纤维细胞；体细胞克隆等。第22页/共67页8.2.1 8.2.1 胚胎分割法胚胎分割法-“-“多胚胎复制多胚胎复制”的原理的原理与方法与方法定义：着床的早期胚胎经显微手术后，分割为二、四、六等多等份，给每个受体子宫内移植一块分割物而妊娠产仔，这样由一个胚胎产生出多个遗传性能完全一样的后代个体。严格讲，这种胚胎克隆只能算“多胚胎复制”。随着分割次数增加，发育成完整个体的能力越差。第23页/共67页(1)(1)基本原理基本原理 软体动物和部分昆虫为镶嵌发育类型软

13、体动物和部分昆虫为镶嵌发育类型:从胚胎发育从胚胎发育的的2 2细胞起，每个分裂球将要发育成什么样的器官细胞起，每个分裂球将要发育成什么样的器官组织，在受精以后就已规定下来。去掉任何一个分组织，在受精以后就已规定下来。去掉任何一个分裂球，就不能发育成为一个完整胚胎。裂球，就不能发育成为一个完整胚胎。大多数哺乳动物为调节发育类型大多数哺乳动物为调节发育类型:具有调节发育的能具有调节发育的能力。力。特点特点：第一第一,去掉早期胚胎的一半，其余部分可以调整发去掉早期胚胎的一半，其余部分可以调整发育方向，仍可形成一个完整胚胎。育方向，仍可形成一个完整胚胎。第二，将两个胚胎融合在一起，仍发育成一个胚胎。第

14、二，将两个胚胎融合在一起，仍发育成一个胚胎。第三，调整发育分化能力随胚胎发育的进行逐渐减第三，调整发育分化能力随胚胎发育的进行逐渐减弱，组织发育方向变得愈来愈固定。直至调整能力完弱，组织发育方向变得愈来愈固定。直至调整能力完全丧失。全丧失。第24页/共67页研究表明，哺乳动物从早期分裂阶段到原肠胚胚胎都能够复制。此后，胚胎的发育能力会随着胚胎所达到的发育阶段而改变。如：分割胚的胚细胞只负责构成胚盘，胚盘的正常发育需要滋养层细胞。所以,在分割胚时应包括应滋养层细胞，否则不足以引起妊娠产仔。第25页/共67页（1 1）卵裂球分离培养法）卵裂球分离培养法用吸管固定胚胎，用玻璃针自上而下切开透明带使其

15、形成一个切口，用微吸管自切口处伸入透明带吸住半数卵裂球，等分胚胎为两部分。将分得的半胚装入空透明带中，置于血清中使其中充满血清。琼脂包埋后，移入受体输卵管。培养35d,发育到桑葚胚或囊胚时回收琼脂筒；去掉琼脂，选择发育好的胚胎进行移植，产仔。第26页/共67页(2)桑葚胚及其以后阶段的直接分割法桑葚胚及其以后阶段的直接分割法这一阶段的胚胎分割时，可用固定吸管固定胚胎或不进行固定而直接分割。囊胚阶段前的胚胎，要对透明带作软化处理。否则，由于透明带的韧性，在分割时一部分卵裂球会受到机械损伤。之后，将胚胎连同少量分割操作液置于分割皿上，用显微玻璃针、显微刀片分割或徒手分割。第27页/共67页图图8-

16、1 8-1 分割针垂直分割胚胎示意图分割针垂直分割胚胎示意图图图8-2 8-2 半胚装入透明带示意图半胚装入透明带示意图图图8-3“8-3“分割刀分割刀”水平分割胚胎示意图水平分割胚胎示意图第28页/共67页8.2.2 8.2.2 细胞核移植技术细胞核移植技术细胞核移植细胞核移植（nuclear transfer）技术是目前最常用的、科技成分含量高的动物克隆技术，是动物克隆技术的核心。细胞核移植技术细胞核移植技术：是利用显微操作仪，将外源细胞的核移植入去核卵母细胞中，经人工活化和体外培养后再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。第29页/共67页(1)(1)原理原理胚胎

17、细胞核移植到成熟卵母细胞中，可因其特殊因子的作用，使植入的核基因表达被重新编排或调整，将“发育钟”拨回到受精状态，即恢复全能性。胚胎干细胞具有全能性及调整能力。胎儿成纤维细胞和成年体细胞等分化细胞在经过“去分化”培养后，可以恢复其全能性。第30页/共67页(2)细胞核移植技术细胞核移植技术第一第一,有三种做核受体的胞质有三种做核受体的胞质：卵母细胞（M期）胞质、原核期受精卵胞质、2C胚胎的胞质。研究表明，以MM期卵母细胞胞质为核移植期卵母细胞胞质为核移植的受体细胞最好的受体细胞最好,目前应用也最普遍。卵母细胞来源有两种：超排（数量少）、屠超排（数量少）、屠宰场收集宰场收集卵丘卵丘-卵母细胞复合

18、体（卵母细胞复合体（COCCOC）在体外培养成熟后作为受体（数量大）。n受体胞质的准备受体胞质的准备第31页/共67页图8-4 核受体成熟卵去核过程示意图第二第二,受体卵去核受体卵去核第32页/共67页核供体细胞的准核供体细胞的准备备核供体细胞主要有两大类三种：胚胎细胞核供体细胞主要有两大类三种：胚胎细胞(胚胎细胞、胚胎干细胞胚胎细胞、胚胎干细胞)和体细胞和体细胞 。第一第一,胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植：通过显微手术分离未着床早期胚胎的单个细胞，并：通过显微手术分离未着床早期胚胎的单个细胞，并将其导入去核的成熟卵母细胞，核质融合后发育为胚胎。将其导入去核的成熟卵母细胞，核质融合后发育为胚胎。

19、第33页/共67页方法方法：消化掉卵裂球外面的黏：消化掉卵裂球外面的黏蛋白层和透明带，用细玻璃管蛋白层和透明带，用细玻璃管吹打胚胎细胞，使其分散成单吹打胚胎细胞，使其分散成单细胞后进行核移植。细胞后进行核移植。如果连续对核移植胚胎分散为如果连续对核移植胚胎分散为单细胞，作细胞核移植供体，单细胞，作细胞核移植供体，得到的克隆胚胎称为第二、第得到的克隆胚胎称为第二、第三代三代.克隆胚，依次类推。克隆胚，依次类推。这种技术称为这种技术称为“胚胎继代克隆胚胎继代克隆”（multiple generational embryo cloning）或）或胚胎再胚胎再克隆克隆（embryo re-clonin

20、g）。）。在山羊，已获得在山羊，已获得1 15 5代连续核代连续核移植山羊移植山羊4545只，其中有只，其中有7 7只山只山羊来自一个胚胎。羊来自一个胚胎。第34页/共67页第二第二,胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植：胚胎干细胞胚胎干细胞是将早期胚胎或胎儿的原始生殖细胞是将早期胚胎或胎儿的原始生殖细胞经体外抑制分化培养后，筛选出的具有发育全能性的细胞经体外抑制分化培养后，筛选出的具有发育全能性的细胞。核移植方法：与胚胎细胞相同。核移植方法：与胚胎细胞相同。利用胚胎干细胞核移植能生产更多的动物个利用胚胎干细胞核移植能生产更多的动物个体。但目前仅在小鼠分离克隆出胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。体。

21、但目前仅在小鼠分离克隆出胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。第35页/共67页第三第三,体细胞核移植体细胞核移植：用已高度分化的细胞作核供体。包括：用已高度分化的细胞作核供体。包括：-胎儿体细胞胎儿体细胞：由妊娠早期胎儿组织分离、克隆以及传代培养的：由妊娠早期胎儿组织分离、克隆以及传代培养的胎儿成纤维胎儿成纤维细胞细胞。-成年体细胞成年体细胞：卵丘细胞、颗粒细胞、乳腺上皮细胞以及皮肤成纤维细胞卵丘细胞、颗粒细胞、乳腺上皮细胞以及皮肤成纤维细胞等。等。第36页/共67页受体受体体细胞供体核供体第37页/共67页再稀释沉淀，分散沉淀细胞再稀释沉淀，分散沉淀细胞体细胞核移植方法：将组织切成碎片将组织切成

22、碎片消化、低速离心（消化、低速离心（1 000r/min1 000r/min）取上清，中速离心（取上清，中速离心（3 000r/min3 000r/min），获沉淀的细胞核），获沉淀的细胞核获得单个体细胞，在获得单个体细胞，在3737、5%CO25%CO2下培养，备用下培养，备用12345第38页/共67页(3)核移植胚的重构（核质融核移植胚的重构（核质融合）合）按照供体核植入受体卵的部位，将细胞核移按照供体核植入受体卵的部位，将细胞核移植分为两种：即胞质内注射和透明带下注射。植分为两种：即胞质内注射和透明带下注射。A.A.胞质内注射胞质内注射：用一个外径：用一个外径5 510m10m的注核的

23、注核针吸取卵母细胞核后，刺破卵质膜，将核直针吸取卵母细胞核后，刺破卵质膜，将核直接注射到受体细胞质内的方法（见下图）。接注射到受体细胞质内的方法（见下图）。B.B.透明带下注射透明带下注射：把供体细胞核注射在透明：把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合，形成重组胚。电刺激进行细胞融合，形成重组胚。第39页/共67页图4-4-17直接注射法制作重组胚过程示意图图85 直接注射法制作重组胚过程示意图第40页/共67页(4)核移植重组胚的激活核移植重组胚的激活激活是胚胎发育所必需的。受精和人工方法均能激活卵母细胞。原理：通

24、过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII中解放出来，并转入“受精”状态。电融合时的电脉冲也施加了激活重组胚的作用。第41页/共67页(5)(5)重组胚的体内或体外培养重组胚的体内或体外培养：将融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑葚胚和囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑葚胚或囊胚。(6)(6)胚胎移植胚胎移植 将合格重组胚胎移植至假孕母体至发育到期产出。第42页/共67页图8-6 小鼠核移植实验与供体基因型一致第43页/共67页图8-8 体细胞克隆小鼠图8-7体细胞克隆小鼠体细胞克隆小鼠技术路线技术

25、路线第44页/共67页第45页/共67页奶牛克隆过程奶牛克隆过程代孕牛第46页/共67页图8-9 以奶牛为例的产生克隆动物技术路线示意图12345供卵动物(黑牛)供核动物供核动物(黑白花牛黑白花牛)几种克隆方法汇总第47页/共67页 体细胞克隆动物体细胞克隆动物-多莉羊的产生多莉羊的产生图8-10 克隆多莉羊技术路线示意图（或植入植入到另一只羊的结扎的输卵管内，体内培养），英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司宣布，于1996年7月无性繁殖了一头雌性小绵羊“多莉”。被誉为二十世纪生物学领域的突破性成就。第48页/共67页图8-11 克隆羊多莉组图第49页/共67页8.3.1 8.3.1 克隆

26、克隆“多莉多莉”羊的具体操作羊的具体操作步骤步骤(1)(1)获获取取供供体体细细胞胞 取取处处于于后后1/31/3妊妊娠娠期期的的6 6岁岁白白色色（白白面面）母母绵绵羊羊A A（芬芬兰兰多多塞塞特特绵绵羊羊）的的乳乳腺腺细细胞胞作作核核供供体体细细胞胞(具具5454条条染染色色体体,体体外外培培养养传传代代到到第第3 3代代至至第第6 6代代细细胞胞),),用用“饥饥娥娥法法”10%FCS10%FCS（foetal calf serum小小牛牛血血清清）、1%FCS1%FCS和和0.5%FCS0.5%FCS连连续续培培养养5 5天，使其进入天，使其进入G G0 0期用作供体细胞。期用作供体细

27、胞。(2)(2)获获取取卵卵母母细细胞胞 给给另另一一只只母母羊羊B B（苏苏格格兰兰黑黑面面绵绵羊羊）注注射射促促性性腺腺激激素素GnGn促促使使其其排排卵卵，取取其其未未受受精精卵卵并并去去核核。用用饥饥饿饿法法连连续续培培养养5d5d，使使其其进进入入G G0 0期期用用作作受受体体细胞。细胞。第50页/共67页(3)(3)重构胚的融合重构胚的融合 将核供体细胞注入去核的卵母细胞将核供体细胞注入去核的卵母细胞的卵周隙。之后，将乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿的卵周隙。之后，将乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下使乳腺细胞融入卵中，形成一个中，在微电流的作用下使乳腺细胞融入卵中

28、，形成一个含有新的遗传物质的卵细胞。含有新的遗传物质的卵细胞。(4)(4)重构胚的孵育与移植重构胚的孵育与移植 新的卵细胞在体外培养（或新的卵细胞在体外培养（或植入到另一只羊的结扎的输卵管内），植入到另一只羊的结扎的输卵管内），6 6天后发育为桑天后发育为桑椹期胚胎或囊胚（椹期胚胎或囊胚（8 81616细胞期），再移植给假孕母羊细胞期），再移植给假孕母羊的子宫内。的子宫内。(5)(5)产下产下6 6岁母羊的复制品岁母羊的复制品-白色白色“多莉多莉”羊。羊。第51页/共67页8.3.2 8.3.2 多莉多莉”羊独特点羊独特点及及成功原因成功原因(1)独特点:核供体是高度分化了的体细胞-乳腺上皮细

29、胞，而非早期胚胎细胞。(2)成功的根本原因：采用血清逐级递减的“饥饿法”减慢细胞生长速度，使核供体细胞与核受体细胞的细胞周期同时进入G0期，通过这一同步方法，实现了胚胎正常发育到期。第52页/共67页8.3.3 8.3.3 对对“多利多利”羊身份的质疑及最后羊身份的质疑及最后的定论的定论(1)(1)质疑质疑：第第 一一，成 功 率 在 低，具 有 偶 然 性。Ian Wilmut用 了 434体 细 胞 277(融 合 成 功)247(输入子宫)29(桑椹胚)13(只绵羊)1头多莉羊。以此计算体细胞移植的成功率，总体是1/434，即成功率为0.23%。第第二二，多莉羊是否真来源于乳腺上皮细胞?

30、供体细胞来源于已死于1995年的一只6岁怀孕绵羊，多莉羊是否来源于乳腺组织中混入的胚胎细胞，若如此，则与几十年前已成功的胚胎细胞核移植无异。第53页/共67页（2 2）验证）验证首先，从生理上讲，由循环系统得到的胚胎可能性很小。因为“胎盘”是一道天然的过滤屏障，胚胎细胞很难透过“胎盘”进入血液循环再到达乳腺。其次，用微卫星DNA技术和DNA指纹分析冷冻的供体乳腺组织、体外培养的乳腺细胞系及多莉羊的血样后，证明产生多莉羊的供体来自高度分化的乳腺细胞 第54页/共67页8.4 8.4 动物克隆存在的问题动物克隆存在的问题 动物克隆技术的不完善性动物克隆技术的不完善性;克隆胚胎妊娠率低、流产克隆胚胎

31、妊娠率低、流产率高；率高；胎儿胎盘大、出生率低；胎儿胎盘大、出生率低；出生后常出现呼吸、消化出生后常出现呼吸、消化等系统的异常。等系统的异常。人们认为这与体细胞在受人们认为这与体细胞在受体卵母细胞中全能性的恢复体卵母细胞中全能性的恢复有关。有关。图812 克隆动物异常第55页/共67页在核移植胚胎中，细胞核和细胞质可以是来源于不同的动物个体，甚至是不同的物种。核质之间协调互作是供核完成重编程并指导全程发育的先决条件。哺乳动物核移植中，无论采用电融合法还是胞质内注射法重构卵，不可避免的将部分供体线粒体带入受体卵胞质，即重构卵胞质中有供体又有受体来源的线粒体。8.5 8.5 线粒体与核移植的关系线

32、粒体与核移植的关系第56页/共67页只剩下受体类型的线粒体。和正常受精胚胎发育中线粒体变化相似，供体来源的线粒体被受体卵胞质所识别，被蛋白水解作用降解并消失;两种来源的线粒体可同时存在。重构胚或核移植个体中的线粒体呈异质性;重构胚或核移植个体中以供体类型的线粒体占主导。受体来源的线粒体被选择性降解，供体来源的线粒体选择性复制。核移植中线粒体可能的三种命运核移植中线粒体可能的三种命运第57页/共67页用线粒体细胞色素B 基因特异的引物扩增体外培养的猕猴-兔异种克隆胚胎中的线粒体DNA，PCRPCR产物经测序证明，产物经测序证明，细胞至囊胚期胚胎中同时存在猕猴体细胞与兔卵胞质来源的线粒体。通过实时

33、荧光定量监测表明，就单个胚胎讲，供体细胞来源的线粒体与受体卵来源的线粒体从1-细胞期到桑椹胚期其含量都保持恒定；卵子来源的线粒体在囊胚期经历复制，而供体细胞源的线粒体在囊胚期略有降解。第58页/共67页8.6 8.6 克隆动物的生命力与生育克隆动物的生命力与生育力力(1)(1)早衰问题早衰问题 1995年5月，克隆“多莉”羊的英国PPL医疗公司和罗斯林研究所宣布，“多莉”的染色体端粒长度比同年龄普通绵羊短20%。随年龄增长，端粒变短。这就意味着“多莉”可能比普通羊衰老得更早。但杨向忠等对10头克隆牛研究发现，克隆动物与并无差异。(2)(2)生育能力生育能力 杨向忠（1999）利用1头13岁母牛

34、的耳朵皮肤细胞克隆牛诞生(在人类相当于80岁)。这头牛的后代通过自然繁殖产下一头重的牛犊。说明老龄细胞经过克隆后可以在遗传和生理上转化成全新的新生细胞。第59页/共67页图8-13 英科学家克隆出人类胚胎 克隆人胚胎引发争议克隆人胚胎引发争议第60页/共67页图813 治疗性克隆与生殖性克隆技术路线示意图第61页/共67页克隆人违犯了伦理学三原克隆人违犯了伦理学三原则则 (1)(1)违违背背了了“不不伤伤害害原原则则”目目前前人人类类知知识识远远没没有有达达到到彻彻底底了了解解人人类类基基因因组组所所有有基基因因功功能能的的水水平平，且且克克隆隆技技术术很很可可能能导导致致大大量量的的流流产产

35、与与残残障障婴婴儿儿。在在家家畜畜不不重要，可以杀掉，人怎么办？重要，可以杀掉，人怎么办？(2)(2)违违背背了了“自自主主原原则则”新新生生命命的的产产生生是是两两性性配配子子随随机机结结合合的的结结果果。克克隆隆生生命命个个体体自自然然将将该该儿儿童童本本属属于于偶然性的部分自由（自主原则）剥夺了偶然性的部分自由（自主原则）剥夺了。(3)(3)违违背背了了 “平平等等原原则则”在在克克隆隆活活动动中中，存存在在一一个个设设计计者者（操操作作克克隆隆的的人人）与与被被设设计计者者（被被克克隆隆出出的的人人）的关系，本质上违背了人与人的的关系，本质上违背了人与人的“平等原则平等原则”。第62页

36、/共67页（1）克隆基础理论研究，弄清楚为什么克隆动物受孕率，存活率低，流产率，死亡率高等一系问题；（2）开展治疗克隆和器官移植，以推动人类更好地解决各种疑难疾病，为人类健康造福。（3）克隆技术的应用，利用克隆技术“复制”优良品种家畜，并逐步推动其实现产业化，直接为市场和经济发展服务；（4）拯救濒危动物，为有效保护提供一种新的思路和方法。“条件成熟时甚至还可以将灭绝物种恢复原状，例如取出掩埋于冰川底下已灭绝动物的体细胞，通过克隆让它们再现于地球”；8.8 8.8 克隆技术未来的发展克隆技术未来的发展8.8.1 一般性研究第63页/共67页（2）重点研究内）重点研究内容容第一,认识去分化细胞是如

37、何重新获得全能性的。对供体细胞核与受体细胞质之间的相互作用关系进行深入研究，从分子水平上阐明已分化的体细胞如何在受体卵母细胞质中去分化而重新获得全能性。第二第二,动物克隆技术与转基因技术或基因敲除技术组结合已成为未来世界各国科学家相互竞争的制高点。利用转基因细胞或基因敲除细胞作为核供体，进行动物克隆，作为未来生物制药工厂；第64页/共67页第三,治疗性克隆是一个重要的研究领域。利用克隆技术获得克隆胚胎，培育胚胎干细胞，并诱导形成临床上要达到治疗目的所需的细胞、组织和器官等。第65页/共67页第八章第八章 习习 题题1.遗传学定义的“克隆”?2.细胞核移植技术？3.细胞核移植常用的供体细胞和受体细胞有那几类?4.细胞核移植技术的一般程序？5.论述克隆羊“多莉”的技术路线及成功的根本原因？6.克隆动物时，受体细胞为什么一般均选用卵母细胞?第66页/共67页感谢您的观看！第67页/共67页