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1、哺乳动物体细胞克隆一、克隆的发展概述一、克隆的发展概述l1938年，德国胚胎学家Spemann建议把一个受精卵的细胞核去掉，然后将发育到较高阶段的细胞核放进去，观察 核 能 否 发 育，这 就 是 核 移 植（nucleartransfer,NT）的开始。但因当时技术条件所限，未能付诸实践，这已经成为当今克隆技术的蓝图。按照供体细胞的类型不同将核移植的发展过程分为三个阶段 l第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植l第二阶段是用体细胞核进行的核移植l第三阶段是异种克隆日期日期动物种类动物种类技术特点技术特点1981小鼠小鼠胚胎细胞胚胎细胞1983小鼠小鼠NT+电融和电融和1986羊羊8-1
2、6细胞胚胎细胞胚胎1994绵羊绵羊胎胎 儿儿 胚胚 盘盘(embryonic disc,ED)体体外外培培养养获获得得细细胞系胞系1997猴猴早期胚胎的卵裂球早期胚胎的卵裂球第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植日期日期动动物种物种类类国家国家1997绵绵羊羊英国英国1998牛牛日本日本1998小鼠小鼠美国美国2000猪猪美国美国2002猫猫美国美国2002兔兔法国法国2003马马意大利意大利2003骡骡美国美国2003大鼠大鼠法国法国2005 狗狗韩韩国国
3、2007狼狼韩韩国国第二阶段是用体细胞核进行的核移植第二阶段是用体细胞核进行的核移植日期日期动物种类动物种类1998“贵妇贵妇”珍稀母牛珍稀母牛2000野黄牛（野黄牛（Bos gaurus）2001“Noah”牛牛2001欧洲盘羊欧洲盘羊第三阶段是异种克隆成功的哺乳动物克隆要事统计表成功的哺乳动物克隆要事统计表成功的哺乳动物克隆要事统计表成功的哺乳动物克隆要事统计表 克隆动物克隆动物供体细胞种类供体细胞种类受体细胞种类受体细胞种类作者作者发表时间发表时间小鼠小鼠合子核合子核受精卵受精卵Mcgrath和和solter1983绵羊绵羊4-16细胞期胚胎细胞期胚胎卵母细胞卵母细胞Willadsen1
4、986牛牛4-细胞期胚胎细胞期胚胎卵母细胞卵母细胞Prather等等1987小鼠小鼠8-细胞期胚胎细胞期胚胎2-细胞胚胎细胞胚胎Tsunoda1987免免8-细胞期胚胎细胞期胚胎卵母细胞卵母细胞Stice和和robl1988猪猪4-细胞期胚胎细胞期胚胎卵母细胞卵母细胞Prather等等1989牛牛内细胞团内细胞团卵母细胞卵母细胞Sims和和first1993猴子猴子4-32细胞期胚胎细胞期胚胎卵母细胞卵母细胞Meng等等1997小鼠小鼠内细胞团和滋养层细胞内细胞团和滋养层细胞卵母细胞卵母细胞Tsunoda和和kato1998绵羊绵羊培养的胚盘细胞培养的胚盘细胞卵母细胞卵母细胞Campbell等
5、等1996绵羊绵羊乳腺细胞乳腺细胞卵母细胞卵母细胞Wilmut等等1997牛牛培养的卵丘及输卵管上皮细胞培养的卵丘及输卵管上皮细胞卵母细胞卵母细胞Kato等等1998小鼠小鼠新鲜分离的卵丘细胞新鲜分离的卵丘细胞卵母细胞卵母细胞Wakayama等等1998牛牛转基因胎儿成纤维细胞转基因胎儿成纤维细胞卵母细胞卵母细胞Wells等等1998珍稀牛珍稀牛培养的成年珍稀牛颗粒细胞培养的成年珍稀牛颗粒细胞卵母细胞卵母细胞Cibelli等等1998山羊山羊转基因胎儿成纤维细胞转基因胎儿成纤维细胞卵母细胞卵母细胞Baguisi等等1999小鼠小鼠成年雄性小鼠尾尖细胞成年雄性小鼠尾尖细胞卵母细胞卵母细胞Maka
6、yama和和Yanegicechi1999小鼠小鼠胚胎干细胞胚胎干细胞卵母细胞卵母细胞Wakayama等等1999牛牛17岁牛耳成纤维细胞岁牛耳成纤维细胞卵母细胞卵母细胞Kubota等等2000猪猪胎儿成纤维细胞胎儿成纤维细胞卵母细胞卵母细胞Onishi等等2000猪猪培养的成年猪卵丘细胞培养的成年猪卵丘细胞卵母细胞和爱精卵卵母细胞和爱精卵Pojejaeve等等2000猪猪胎儿成纤维细胞胎儿成纤维细胞卵母细胞卵母细胞Betthauser等等2000盘羊盘羊盘羊颖粒细胞盘羊颖粒细胞卵母细胞卵母细胞Loi等等2001猫猫培养的成年猫卵丘细胞培养的成年猫卵丘细胞卵母细胞卵母细胞Shin等等2002免
7、免卵丘细胞卵丘细胞卵母细胞卵母细胞Chesne等等2002二、克隆的研究方法 l常规方法l连续核移植方法l2N-4N嵌合体产生完全来源于供核细胞激活激活去核卵母细胞去核卵母细胞取出核取出核核供体动物核供体动物重构克隆胚胎重构克隆胚胎电融合电融合供核细胞供核细胞MII期期卵母细胞卵母细胞注注入入支支核核卵卵母母细胞间周隙细胞间周隙注注 入入 去去 核核卵母细胞卵母细胞与与去去核核卵卵母母细胞共培养细胞共培养移植移植体外培养体外培养发育的胚胎发育的胚胎体内培养体内培养克隆动物克隆动物代孕母代孕母示示成成熟熟卵卵母细胞母细胞超排超排卵巢卵巢体外成熟体外成熟胞质供体动物胞质供体动物哺哺乳乳动动物物克克
8、隆隆程程序序常规哺乳动物克隆程序常规哺乳动物克隆程序卵母细胞体外成熟卵母细胞体外成熟 A：刚抽出的卵母细胞；B：IVM（体外成熟）19小时的卵母细胞；C：成熟的卵母细胞体细胞移植过程体细胞移植过程 A-E：盲去法；F-J：挤压法体细胞核移植重构胚体外发育各阶段体细胞核移植重构胚体外发育各阶段 A：核移植；B：融合卵；C：2细胞；D：4细胞；E：8细胞；F：8-16细胞；G：16细胞；H：32细胞；I：囊胚；J：孵化囊胚连续核移植连续核移植 A：培养贴壁的体细胞、B：消化下来供体核移植的体细胞、C体细胞核移植、D：重构囊胚经链霉蛋白酶消化掉透明带、E：经无钙离子、镁离子的培养液处理后分离成单个卵
9、裂球、F：连续核移植、G：融合卵、H：重构囊胚连续核移植方法连续核移植方法 卵母细胞受精卵培养的体细胞三种连续核移植方法示意图（黑色箭头：体细胞核移植；红色箭头：以重构胚裂球作为供核；蓝色箭头：原核互换；紫色箭头：2-细胞互换）卵母细胞2N-4N2N-4N嵌合体产生完全来源于供核细胞嵌合体产生完全来源于供核细胞 受精卵2-细胞电融合形成4倍体胚胎2N的ES细胞4N胚胎细胞来源的胎盘体外培养的ES细胞系2N的ES细胞内细胞团卵母细胞培养的体细胞三、动物克隆的应用 l治疗性克隆l与转基因技术结合生产转基因克隆动物l拯救濒危动物治疗性克隆 病人病人移植移植去核卵母细胞去核卵母细胞休细胞活检休细胞活检
10、胚胎分裂胚胎分裂囊胚囊胚造血干细胞造血干细胞肌肉细胞肌肉细胞诱导分化诱导分化神经细胞神经细胞（胚胎干细胞）（胚胎干细胞）内细胞团培养内细胞团培养免疫手术法免疫手术法体细胞核移植体细胞核移植内细胞团内细胞团基因打靶动物基因打靶动物核供体动物核供体动物动物胚胎动物胚胎胎儿胎儿成年动物成年动物ESPGCs卵裂球卵裂球胎胎儿儿成成纤纤维细胞维细胞各种体细胞各种体细胞基因打靶基因打靶细胞系细胞系细胞系细胞系细胞系细胞系显微注射显微注射基基因因转转染染外外源基因源基因打靶载体打靶载体分子生物学分子生物学超排超排重构胚重构胚代孕母代孕母克隆动物克隆动物供核细胞供核细胞克隆技术克隆技术动动物物囊囊胚胚注射注射
11、胚胚胎胎移移植植技术技术转基因动物转基因动物活体采卵活体采卵新鲜卵巢新鲜卵巢代孕母代孕母应用应用农业、医学、生物学、动物模型、器官移植农业、医学、生物学、动物模型、器官移植分子生物学分子生物学动物受精卵动物受精卵卵卵母母细细胞胞胞胞质质供供体体动动物物体体外外培培养养克隆技术与其他技术的关系克隆技术与其他技术的关系克克隆隆技技术术与与基基因因修修饰饰基因打靶克隆羊正常出生三周龄转基因克隆牛四、受体胞质与供体细胞核的细胞周期相互关系 l受体l供体细胞l维持重构胚正确倍性受体 l去除原核的合子供体：原核或假原核l早期胚胎供体：具有全能性的卵裂球lMII卵母细胞 供体：各阶段胚胎的卵裂球、早期胎儿细
12、胞、体细胞、ES细胞 供体细胞 l早期胚胎卵裂球；胚胎干细胞；分化的体细胞lG1/G0（NEBD、PCC）单倍染色单体lS（NEBD、PCC）DNA损伤lG2、M（NEBD、PCC）双倍染色单体维持重构胚正确倍性 l移入确定细胞周期阶段的细胞核：G1/G0，G2，Ml先激活卵母细胞受体：万能受体用MII卵母细胞作为受体几种不同的核质组合 l移核的同时伴随MPF活性的下降l延迟活化：移植过一段时间之后，在激活卵母细胞；融合液中不含钙、镁离子l先活化卵母细胞：（万能受体）但不利于核重新编程l核移植过程中基因组的后生（核移植过程中基因组的后生（Epigenetic）重新程重新程序化序化l l胚胎干细
13、胞（胚胎干细胞（胚胎干细胞（胚胎干细胞（ESES）细胞和体细胞的发育能力细胞和体细胞的发育能力细胞和体细胞的发育能力细胞和体细胞的发育能力l lX-X-染色体失活染色体失活染色体失活染色体失活l l端端端端 粒粒粒粒l供体细胞和受体卵母细胞线粒体的命运供体细胞和受体卵母细胞线粒体的命运l克隆动物的表型克隆动物的表型五、克隆动物发育异常五、克隆动物发育异常供核细胞重构胚数 量/个形成囊胚移植胚数 量/个出生文献数量/个表成率/%数量/个出生率/%绵羊胚盘细胞系2443413.934514.7Campbell1966绵羊胚盘细胞系25512649.48744.6Wolmut1997绵羊胎儿成纤维细
14、胞1484731.84037.5Wilmut1997绵羊乳腺细胞2472910.92913.4Wilmut1997绵羊胎儿成纤维细胞5076913.667710.4Schnieke1997绵羊胎儿成纤维细胞3938014.2801417.5McCreath2000山羊胎儿成纤维细胞28512042.111232.7Baguisi1999恒河猴胚胎切割3681317.6Chan2000牛肌细胞1474530.65480.0Shiga1999牛胎儿成纤维细胞2763311.928414.3Gibelli1998牛卵丘细胞471838.36583.3Kato1998输卵管上皮细胞942021.343
15、75.0Kato1998胎儿成纤维细胞1725934.33239.4Hill2001小鼠卵丘细胞2468138556.11385312.2Wakayama1998小鼠胚胎干细胞176532318.331451.6Wakayama1999猪胎儿成纤维细胞39726967.82693412.6Onishi2000猪粒细胞1837239.37256.9Polojaeva2000不同文献获得的克隆效率不同文献获得的克隆效率核移植过程中基因组的后生（Epigenetic）重新程序化和配子的发生过程不同 克隆胚胎的重新程序化和配子的发生过程不同 l供体基因没有重新编程克隆胚胎死亡l供体基因部分重新编程发育
16、异常l供体基因成功重新编程产生正常的动物胚胎干细胞（ES）细胞和体细胞的发育能力 供体细胞发育阶段囊胚新生儿成体ES细胞10-20%5-21%1-15%卵丘细胞70%2-3%1-2%成纤维细胞58%0.5-1%0.5%lES细胞的囊胚发育率低而卵丘细胞的囊胚发育率高，因为ES细胞60%处于S期，卵丘细胞90%以上处于G0或G1期lES细胞的重构胚移植后能发育到期的比例是体细胞的10-20倍，未分化的ES细胞需要的重编程少，基因组的后生状态与早期胚胎更相似，更有利于作核供体X-染色体失活 From Seminars in Cell&Developmental Biology,2003克隆动物的X
17、-染色体失活 组织X染色体失活正常雌性胚胎核移植雌供核胚胎的胚胎系（外胚层）随机随机胚胎外的滋养层（TE）父本随机X染 色 体失活有关基因胚胎发育阶段桑椹胚囊胚G6PD显著提高PGK相似显著降低Xist显著提高显著提高端 粒l克隆个体的细胞端粒长度与体细胞端粒长度是否一致?克隆个体一出生其细胞的寿命就与体细胞相同，会出现早衰现象?l包括“多莉”在内的克隆绵羊细胞的端粒长度比正常的要短l端粒长度的恢复与胚胎发育过程中端粒酶的活性升高有关 l端粒酶活性的重新表达用作判断重构胚核重编程程度和时间的一个标志八、供体细胞和受体卵母细胞线粒体的命运 l 同种克隆l 异种克隆l结论同种克隆 动物种类线粒体D
18、NA来源10头克隆羊（血、骨骼肌、胎盘、奶）受体十头克隆牛七头-供体：受体比例不变三头-供体来源的线粒体在显著减少甚至没有备注线粒体DNA的异质性可能是哺乳动物死亡率以及异常的一个原因?异种克隆 供体受体线粒体BosgaurusBostaurus受体欧洲盘羊受体Bosindicus桑椹胚卵裂球Bostaurus卵母细胞8细胞前：供体无变化8细胞后：供体很少（0-0.005%）或没有55天胎儿各种组织：2.7%受体克隆个体：无受体大熊猫体细胞兔卵母细胞着床前胚胎：供受体共存着床后：供体l通过核移植的方法来纠正与母性线粒体DNA遗传异常有关l用此方法产生异质性线粒体DNA疾病的动物模型结论：核移植过程中供体来源的线粒体命运如何还没有一个完全一致的规律，但总的来说供体来源的线粒体是呈减少的趋势克隆动物的表型l 发育异常发育异常l印记基因异常印记基因异常发育异常 l呼吸系统l循环系统l免疫系统、肾、大脑障碍 后期死亡l胎儿过重综合症(有：牛、绵羊、小鼠；无：山羊、猪)与着床及着床后发育期重要作用的基因（IL6、FGF4、FGFr2）在一部分核移植的桑椹胚和囊胚中异常表达心脏卵圆孔闭合不全心脏卵圆孔闭合不全 肝脏大囊肿肝脏大囊肿 脂肪肾脂肪肾实心肺实心肺无大脑无大脑在胚胎发育过程中起重要作用的双亲印记基因异常表达 谢 谢！