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1、生物化学课件33.1.1 核酸的概念和重要性核酸的概念和重要性概念概念：核酸（核酸（nucleic acids）是一类是一类重要的生物大分子，在生物体内负重要的生物大分子，在生物体内负责生命信息的储存和传递。责生命信息的储存和传递。核酸是以核苷酸（核酸是以核苷酸（nucleotidenucleotide）为为基本结构单元的生物大分子，分为脱氧基本结构单元的生物大分子，分为脱氧核糖核酸（核糖核酸（deoxyribonucleic aciddeoxyribonucleic acid，DNADNA）和核糖核酸（和核糖核酸（ribonucleic acidribonucleic acid，RNARNA
2、）两大类。两大类。DNA 分子的大小：分子的大小：天然存在的天然存在的 DNA 分子最显著的特点是很长，分分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在子质量很大，一般在 10 6 10 10 D。DNA分子的形状：分子的形状：有有的的 DNA 呈呈双双股股线线型型分分子子（double strand DNA，dsDNA），有有些些为为双双股股环环状状，也也有有少少数数呈呈单单股股（single strand，ssDNA）环状。环状。DNA的碱基组成的特点的碱基组成的特点 1具有种的特异性具有种的特异性。2没有器官和组织的特异性。没有器官和组织的特异性。3DNA 的碱基组成符合碱基摩尔的碱基组成
3、符合碱基摩尔比例规律。比例规律。4年龄、营养状况、环境的改变年龄、营养状况、环境的改变不影响不影响 DNA 的碱基组成。的碱基组成。DNA的的碱碱基基组组成成符符合合碱碱基基摩摩尔尔比比例例规规律律(DNA 的碱基当量定律的碱基当量定律)：在在各各种种 DNA 中中，腺腺嘌嘌呤呤 与与 胸胸腺腺嘧嘧啶啶 的的摩摩尔尔数数相相等等，即即 AT，鸟鸟嘌嘌呤呤 与与 胞胞嘧嘧啶啶(包包括括 5甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶)的的摩摩尔尔数数相相等等，即即 G C+m5 C；因因此此嘌嘌呤呤碱碱基基的的总总摩摩尔尔数数等等于于嘧嘧啶啶碱碱基基的的总总数数，即即 A+G T+C+mC。这这个个碱碱基基摩摩尔尔比比
4、例规律称为例规律称为 DNA 的碱基当量定律。的碱基当量定律。重要性重要性 （1）DNA是主要遗传物质。是主要遗传物质。DNA DNA 分子能够自我复制。传递信息给子代。然后分子能够自我复制。传递信息给子代。然后通过转录，再翻译，把通过转录，再翻译，把 DNA DNA 上的遗传信息经上的遗传信息经 RNA RNA 传递传递到蛋白质结构上。到蛋白质结构上。（2 2）RNA的功能多样性的功能多样性。控制蛋白质合成；控制蛋白质合成；作用于作用于RNARNA转录后加工与修转录后加工与修 饰过程；饰过程；参与基因表达与细胞功能的调节；参与基因表达与细胞功能的调节；进行进行遗传信息的加工与促进生物进化；遗
5、传信息的加工与促进生物进化；具有生物催化与其具有生物催化与其他细胞基本功能。他细胞基本功能。3.1.2 核酸的化学组成核酸的化学组成 3.1.2.1 碱基碱基 3.1.2.2 戊糖戊糖 3.1.2.3 磷酸磷酸 3.1.2.4 核苷核苷 3.1.2.5 核苷酸核苷酸核酸的水解：核酸的水解：3.1.2.1碱基碱基（1）嘌呤碱嘌呤碱 （2）嘧啶碱）嘧啶碱（3）稀有碱基）稀有碱基 3.1.2.2 戊糖戊糖 3.1.2.3 磷酸磷酸是一种三元酸，可以与另一分子核苷酸是一种三元酸，可以与另一分子核苷酸中戊糖未被结合的羟基缩合，形成磷酸中戊糖未被结合的羟基缩合，形成磷酸二酯键，将两分子核苷酸连接起来。多二
6、酯键，将两分子核苷酸连接起来。多个核苷酸按此方式连接起来，即形成核个核苷酸按此方式连接起来，即形成核酸。酸。3.1.2.4 核苷核苷核苷是由一个核苷是由一个 戊糖（核糖戊糖（核糖 或或 脱氧核糖）和一个脱氧核糖）和一个碱基（嘌呤碱基（嘌呤 或或 嘧啶碱）缩合成的糖苷，戊糖的嘧啶碱）缩合成的糖苷，戊糖的第第 1 位碳原子与嘧啶碱的位碳原子与嘧啶碱的 第第 1 位氮原子或嘌呤位氮原子或嘌呤碱第碱第 9 位氮原子相连接。位氮原子相连接。RNA 中的核苷称核糖核苷（或称核苷），包括中的核苷称核糖核苷（或称核苷），包括由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和核糖构由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和核糖构成的腺
7、苷（成的腺苷（A A）、鸟苷（）、鸟苷（G G）、胞苷（）、胞苷（C C）、尿）、尿苷（苷（U U ）。DNA 中的核苷称脱氧核糖核苷（或称脱氧核苷）中的核苷称脱氧核糖核苷（或称脱氧核苷），主要有脱氧腺苷（，主要有脱氧腺苷（dAdA）、脱氧鸟苷（）、脱氧鸟苷（dGdG）、脱氧胞苷（、脱氧胞苷（dCdC）和脱氧胸苷（）和脱氧胸苷（dTdT）。）。（“d”d”表示脱氧）表示脱氧）3.1.2.5 核苷酸核苷酸 核苷酸是由核苷中戊糖的核苷酸是由核苷中戊糖的羟羟基与磷酸基与磷酸缩缩合而成合而成的磷酸的磷酸酯酯，它，它们们是构成核酸的基本是构成核酸的基本单单位。位。分分类类：核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。核
8、糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。天然核酸中：天然核酸中：RNA：主要由腺苷酸、鸟苷酸、尿苷酸、胸主要由腺苷酸、鸟苷酸、尿苷酸、胸苷酸四种核糖核苷酸组成。苷酸四种核糖核苷酸组成。DNA：主要是由脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱主要是由脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧胸苷酸四种脱氧核苷酸组成。氧胞苷酸、脱氧胸苷酸四种脱氧核苷酸组成。核苷酸的磷酸化：核苷酸的磷酸化：核苷酸分子都只含有一个磷酸基，故统称为核苷一磷酸核苷酸分子都只含有一个磷酸基，故统称为核苷一磷酸（NMP NMP）。）。但但55核苷酸的核苷酸的 磷酸基磷酸基 都可进一步磷酸化形成相都可进一步磷酸化形成相应的核苷二磷酸（应的核苷二磷酸（NDP
9、 NDP）和核苷三磷酸（和核苷三磷酸（NTP NTP）。）。例如例如55腺苷酸，又称腺一磷（腺苷酸，又称腺一磷（AMP AMP），），进一步磷酸化生成腺二进一步磷酸化生成腺二磷（磷（ADP ADP）和腺三磷（和腺三磷（ATP ATP）。）。3.2 核酸的一级结构核酸的一级结构3.2.1核酸中核苷酸的连接方式核酸中核苷酸的连接方式3.2.2 DNA和和RNA的一级结构的一级结构核酸的一核酸的一级结级结构构概念：概念：是指在多核苷酸是指在多核苷酸链链中各个核苷酸之中各个核苷酸之间间的的连连接方式、核苷酸的种接方式、核苷酸的种类类、数量以及核、数量以及核苷酸的排列苷酸的排列顺顺序。序。3.2.1核酸
10、中核苷酸的连接方式核酸中核苷酸的连接方式连接方式：连接方式：3,5磷酸二酯键磷酸二酯键在在核核苷苷酸酸之之间间的的磷磷酸酸基基，一一方方面面与与前前一一个个核核苷苷的的C C3 3-OHOH以以酯酯键键连连接接，另另一一方方面面与与后后一一个个核核苷苷C C5 5-OH-OH以以酯酯键键连连接接，即即形形成成2 2个个酯酯键键。这这样样鱼鱼贯贯的的连连接接下下去去，构构成成无无分分支支多多核核苷苷酸酸链链大大分分子子，其其中中磷磷酸酸基基和和戊戊糖糖基基构构成成多多核核苷苷酸酸链链的的骨骨架架，可可变变部部分分是是碱碱基基排排列列顺顺序序。形形成成的的核核苷苷酸酸链链都都具具有有游游离离的的5
11、5磷磷酸酸基基团团的的5 5 端端和和一一个个具具有有游游离的离的3 3 羟基基团的羟基基团的3 3 端。端。3.2.2 DNA和和RNA的一级结构的一级结构 DNA分分子子是是由由4种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）按按照照一一定定的的排排列列顺顺序序通通过过磷磷酸酸二酯键连接而成的没有分支的多核苷酸链。二酯键连接而成的没有分支的多核苷酸链。RNA 也也是是无无分分支支的的线线型型多多聚聚核核苷苷酸酸，主主要要由由4种种核核苷苷酸酸（AMP、GMP、CMP、UMP）通通过过磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接形形成成没没有有分分支支的的多多核核苷苷酸酸链链。这这些些核
12、核苷苷酸酸中中的的戊戊糖糖不不是是脱脱氧氧核核糖糖，而而是是核核糖糖。RNA分子中还有某些稀有碱基。分子中还有某些稀有碱基。3.3 DNA 的结构与功能的结构与功能3.3.1 DNA 的双螺旋结构的双螺旋结构3.3.2 DNA 三级结构三级结构 3.3.3 DNA 的功能的功能 Watson 和和 Crick 于于 1953 年提出了年提出了 DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 模型，说明了模型，说明了 DNA 的的二级结构，它是本世纪最重大的自二级结构，它是本世纪最重大的自然科学成果之一。然科学成果之一。3.3.1 DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 DNA分子特征：分子特征：（1）由两条平行的多核
13、苷酸链，以相反的方）由两条平行的多核苷酸链，以相反的方向，向，(即一条由即一条由3向向5，另一条由，另一条由5向向3)，围绕，围绕着同一个（想象的）中心轴，以右手旋转方式着同一个（想象的）中心轴，以右手旋转方式构成一个双螺旋形状。构成一个双螺旋形状。（2）疏水的嘌呤和嘧啶碱基平面层迭于螺旋）疏水的嘌呤和嘧啶碱基平面层迭于螺旋的内侧，亲水的磷酸基和脱氧核糖以磷酸二酯的内侧，亲水的磷酸基和脱氧核糖以磷酸二酯键相连成的骨架位于外侧键相连成的骨架位于外侧。（3）内侧碱基呈平面状，碱基平面与中心轴相）内侧碱基呈平面状，碱基平面与中心轴相垂直。每个平面上有两个碱基（每条各一个）形垂直。每个平面上有两个碱基
14、（每条各一个）形成碱基对。相邻碱基平面在螺旋轴之间的距离为成碱基对。相邻碱基平面在螺旋轴之间的距离为 3.4nm。旋转夹角为旋转夹角为36。因此每因此每10 对核苷酸绕中对核苷酸绕中心轴旋转一圈，故螺旋的螺距为心轴旋转一圈，故螺旋的螺距为 34nm。（4）双螺旋的直径为）双螺旋的直径为20nm，沿螺旋的中心轴形沿螺旋的中心轴形成大沟和小沟交替出现。成大沟和小沟交替出现。（5）两条链被碱基对之间形成的氢键而稳定的）两条链被碱基对之间形成的氢键而稳定的维系在一起。在维系在一起。在 DNA 中碱基总是由腺嘌呤与胸腺中碱基总是由腺嘌呤与胸腺嘧啶配对（用嘧啶配对（用AT表示），由鸟嘌呤与胞嘧啶配表示），
15、由鸟嘌呤与胞嘧啶配对（用对（用GC）表示。表示。DNA 双螺旋结构的稳定性的三种力量双螺旋结构的稳定性的三种力量 （1）互补碱基之间有氢键互补碱基之间有氢键 （2）DNA分子中的碱基堆积力分子中的碱基堆积力 （3）离子键离子键 DNA 的的遗遗传传信信息息是是由由碱碱基基的的精精确确排排列列顺顺序序决决定定的的。生生物物的的遗遗传传信信息息就就储储存存于于 DNA 的的核核苷苷酸酸序序列列中中，因因此此测测定定核核苷苷酸酸序序列列是是分分子子生生物物学学的的重重要要课课题题，70年年代代后后期期，Sanger 和和 Gilbert 等等分分别别建建立立了了 DNA 中中核核苷苷酸酸顺顺序序快快
16、速测定法，推动了核酸研究的进展。速测定法，推动了核酸研究的进展。3.3.2 DNA 三级结构三级结构 DNA的三级结构是指的三级结构是指DNA双螺旋结构通过双螺旋结构通过进一步扭曲和折叠所形成的更加复杂的构象，进一步扭曲和折叠所形成的更加复杂的构象，包括线状双链中的扭结、超螺旋、多重螺旋、包括线状双链中的扭结、超螺旋、多重螺旋、分子内局部单链环、环状分子内局部单链环、环状DNA中的超螺旋等中的超螺旋等拓扑特征。拓扑特征。病毒超螺旋：病毒超螺旋：真核细胞的三级结构：真核细胞的三级结构：3.3.3 DNA 的功能的功能DNA的基本功能是作为生物遗传信息复的基本功能是作为生物遗传信息复制的模板和基因
17、转录的模板，它是生制的模板和基因转录的模板，它是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础。命活动的基础。3.4 RNA的结构与功能的结构与功能3.4.1 信使信使RNA的结构与功能的结构与功能3.4.2 转移转移RNA的结构与功能的结构与功能3.4.3 核糖体核糖体RNA的结构与功能的结构与功能3.4.1 信使信使RNA的结构与功能的结构与功能 概述概述:（1）占细胞中）占细胞中 RNA 总量的总量的 35。（2）分子质量极不均一。）分子质量极不均一。（3）细胞内）细胞内 mRNA 的种类是很多。的种类是很多。（4）mRNA 是三类是三类 RNA 中最不稳
18、定的。中最不稳定的。功功能能：mRNA的的功功能能是是把把核核内内DNA的的碱碱基基顺顺序序按按照照碱碱基基互互补补的的原原则则抄抄录录并并转转送送至至胞胞液液，在在蛋蛋白白质质合合成成中中用用以以翻翻译译成成蛋蛋白白质质中中氨氨基基酸酸的的排排列顺序。列顺序。mRNA 3 末端末端 的结构的结构:极大多数真核细胞极大多数真核细胞 mRNA 在在 3 末端有一个长约末端有一个长约 200 个核苷酸的个核苷酸的 polyA。PolyA 是在转录后经是在转录后经 polyA 聚合酶聚合酶 的作用而添加的作用而添加上去的。原核生物的上去的。原核生物的 mRNA 一般无一般无 3 PolyA。Poly
19、A 可能有多方面功能：可能有多方面功能：与与 mRNA 从细胞核到从细胞核到细胞质的转移有关；与细胞质的转移有关；与 mRNA 的半衰期有关。新合成的半衰期有关。新合成的的 mRNA，PolyA 链长，而衰老的链长，而衰老的 mRNA，PolyA 链较链较短。短。mRNA 5 端的帽子结构端的帽子结构 真真核核细细胞胞 mRNA 在在 5 端端有有帽帽子子结结构构。最最简简单单的的 5 端端帽帽子子结结构构，是是调调转转方方向向的的 7-甲甲基基鸟鸟苷苷三三磷磷酸酸，它它与与 mRNA 原原来来的的5 端端核核苷苷酸酸借借 5ppp5 连连接接形形成成 m7GpppN。作作用用：5 端端帽帽子
20、子结结构构对对稳稳定定 mRNA 及及其其翻翻译译具具有有重重要要意意义义。它它作作为为一一种种保保护护装装置置将将 mRNA 5 端端封封闭闭起起来来，可可使使 mRNA 免免受受核核酸酸外外切切酶酶的的水水解解破破坏坏，它它还还作作为为蛋蛋白白质质合合成成系系统统的的辨辨认认信信号号被被专专一一的的蛋蛋白白因因子子所所识识别，从而启动翻译过程。别，从而启动翻译过程。3.4.2 转移转移RNA的结构与功能的结构与功能概述：概述：tRNA 约占约占 RNA 总量的总量的 15，通常以游离的状，通常以游离的状态存在于细胞质中。态存在于细胞质中。细胞内细胞内 tRNA 的种类很多，每的种类很多，每
21、一种氨基酸都有其相应的一种或几种一种氨基酸都有其相应的一种或几种 tRNA。功能：功能：tRNA 在蛋白质生物合成过程中具有转运在蛋白质生物合成过程中具有转运氨基酸和识别密码子的作用。氨基酸和识别密码子的作用。主要是携带活化主要是携带活化了的氨基酸，并将其转运到与核糖体结合的了的氨基酸，并将其转运到与核糖体结合的 mRNA 上用以合成蛋白质。上用以合成蛋白质。它在蛋白质生物合成它在蛋白质生物合成的起始过程中，在的起始过程中，在 DNA 反转录合成中及其他代反转录合成中及其他代谢和基因表达调节中也起重要作用。谢和基因表达调节中也起重要作用。tRNA 一级结构一级结构 tRNA 皆皆由由 70-9
22、0 个个核核苷苷酸酸组组成成，有有较较多多的的稀稀有有碱碱基基核核苷苷酸酸。分分子子质质量量在在25，000左左右，在三类右，在三类 RNA 中它的分子质量最小。中它的分子质量最小。通通常常tRNA 3-末末端端为为-C-C-AOH，用用来来接接受受活活化化的的氨氨基基酸酸。5末末端端大大多多为为pG，也有也有pC的。的。tRNA二级结构与三级结构二级结构与三级结构 碱基排列成三叶草式（碱基排列成三叶草式（clover leaf）。）。双链互补区构成三双链互补区构成三叶草的叶柄，突环好象三片小叶。大致分为氨基酸臂、二氢叶草的叶柄，突环好象三片小叶。大致分为氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码子环、额
23、外环和尿嘧啶环、反密码子环、额外环和TC环等五部分环等五部分。3.4.3 核糖体核糖体RNA的结构与功能的结构与功能 概概述述：RNA是是细细胞胞内内含含量量最最多多的的RNA，约占约占RNA总量的总量的80以上。以上。rRNA与与蛋蛋白白质质共共同同构构成成核核糖糖体体或或称称为为核核蛋蛋白白体体（ribosome），其其中中蛋蛋白白质质约约占占40，rRNA约占约占60。核核糖糖体体中中催催化化肽肽键键合合成成的的是是rRNA，蛋蛋白白质只是维持质只是维持rRNA构象，起辅助作用构象，起辅助作用。大肠杆菌核糖体中有三类大肠杆菌核糖体中有三类 rRNA：5S rRNA，16S rRNA，23
24、S rRNA。动物细胞核糖体动物细胞核糖体RNA有四类：有四类：5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA。3.4.4 其他小分子其他小分子 RNA3.4.4.1 真核细胞的小分子真核细胞的小分子RNA3.4.4.2 原核细胞的小分子原核细胞的小分子RNA 3.5 核酸的理化性质及其应用核酸的理化性质及其应用3.5.1 核酸的一般理化性质核酸的一般理化性质 3.5.2 DNA的变性、复性的变性、复性3.5.3 DNA的熔解温度的熔解温度3.5.4 核酸的杂交及应用核酸的杂交及应用3.5.1 核酸的一般理化性质核酸的一般理化性质（1）DNA微溶于水，呈酸性，加碱促进溶
25、解，微溶于水，呈酸性，加碱促进溶解，但不溶于有机溶剂。但不溶于有机溶剂。（2）核酸和蛋白质一样具有变性现象。）核酸和蛋白质一样具有变性现象。（3）由于核酸组成中的嘌呤、嘧啶碱都具有）由于核酸组成中的嘌呤、嘧啶碱都具有共轭双键，因此对紫外光有强烈的吸收。核酸共轭双键，因此对紫外光有强烈的吸收。核酸溶液在溶液在 260nm 附近有一个最大吸收值。附近有一个最大吸收值。（4）变性）变性 DNA，在适当的条件下可复性。，在适当的条件下可复性。（5）DNA的变性和复性都是以碱基互补为基的变性和复性都是以碱基互补为基础的，因此可以进行分子杂交。础的，因此可以进行分子杂交。3.5.2 DNA的变性、复性的变
26、性、复性DNA的变性的变性 定义：定义：指指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解分子由稳定的双螺旋结构松解为单链无规则线性结构的现象。为单链无规则线性结构的现象。DNA的变性只的变性只涉及维持双螺旋稳定性的次级键的断裂，不涉涉及维持双螺旋稳定性的次级键的断裂，不涉及共价键的断裂，所以其一级结构并不改变。及共价键的断裂，所以其一级结构并不改变。引起引起 DNA 变性的因素：变性的因素：凡凡能能破破坏坏双双螺螺旋旋稳稳定定性性的的因因素素都都可可以以成成为为变变性性的的条条件件。由由温温度度升升高高而而引引起起的的变变性性称称为为热热变变性性。由由酸酸碱碱度度改改变变引引起起的的称称为为酸酸碱碱变变性
27、性，如如极极端端的的pH。另另外外，有有机机试试剂剂如如甲甲醇醇、乙乙醇醇、尿尿素素、甲甲酰酰胺胺等等，均均可可破破坏坏双双螺螺旋旋结结构构引引起起DNA的的变变性性。变变性性能能导导致致DNA一一些理化及生物学性质的改变。些理化及生物学性质的改变。变变性性后后的的 DNA，其其生生物物活活性性丧丧失失，同同时时发发生生一一系系列列理理化化性性质质的的改改变变，包包括括：粘粘度度下下降降；沉沉降降系数增加；系数增加；比旋下降；比旋下降；紫外光吸收值升高等。紫外光吸收值升高等。增色效应：增色效应：变变性性后后的的 DNA 由由于于碱碱基基对对失失去去重重迭迭，所所以以在在 260nm 处处的的紫
28、紫外外光光吸吸收收有有明明显显升升高高，这这种种现现象象称称为增色效应。为增色效应。由由于于变变性性后后，氢氢键键断断开开，碱碱基基堆堆积积破破坏坏、碱碱基基发发色色基基团团暴暴露露，紫紫外外光光的的吸吸收收升升高高，约约可可增增加加 30一一 40 或更高一些。或更高一些。复性复性 定定义义：变变性性 DNA 分分开开的的两两条条链链又又重重新新缔缔合合而而恢恢复复成成双双螺螺旋旋结结构构，这这个个过过程程称称为为复复性。性。适适用用范范围围：DNA 的的复复性性一一般般只只适适用用于于均均一一的的病病毒毒和和细细菌菌的的 DNA，至至于于哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中的的非非均均一一 DNA
29、，很难恢复到原来的结构状态。很难恢复到原来的结构状态。这这是是因因为为各各片片段段之之间间只只要要有有一一定定数数量量的的碱碱基基彼彼此此互互补补，就就可可以以重重新新组组合合成成双双螺螺旋旋结结构构，碱基不互补的区域则形成突环。碱基不互补的区域则形成突环。复性速度受很多因素的影响：复性速度受很多因素的影响：顺序简单的顺序简单的 DNA 分子比复杂的分子复分子比复杂的分子复性要快；性要快；DNA 浓度愈高，愈易复性；此外，浓度愈高，愈易复性；此外，DNA片段大小、溶液的离子强度等对复性速片段大小、溶液的离子强度等对复性速度都有影响。度都有影响。复性后复性后DNA的一系列物理化学性质能得的一系列
30、物理化学性质能得到恢复，如紫外光吸收值下降，粘度增高，到恢复，如紫外光吸收值下降，粘度增高，比旋增加，生物活性也得到部分恢复。比旋增加，生物活性也得到部分恢复。3.5.3 DNA的熔解温度的熔解温度DNA 加热变性过程是在一个狭窄的温度加热变性过程是在一个狭窄的温度范围内迅速发生的，它有点范围内迅速发生的，它有点 像晶体的熔像晶体的熔融。融。Tm：通常将通常将 50 的的 DNA 分子发生变性时分子发生变性时的温度称为解链温度的温度称为解链温度（melting temperature，Tm），一般用，一般用 “Tm”符号符号表示。表示。DNA 的的 Tm 值一般在值一般在 8295之间。之间。
31、DNA加热变性的温度范围：加热变性的温度范围：影响影响 Tm 值的因素：值的因素：（1）DNA 的性质和组成。的性质和组成。A.均均一一的的DNA（如如病病毒毒DNA），Tm 值值范范围围较较小小。非非均均一一的的 DNA，Tm 值值在在一一个个较较宽宽的的温温度度范范围围内内。所所以以Tm 值值可可作作为为衡衡量量 DNA 样样品品均均一一性性的的指指标。标。B.G-C 对含量愈高的对含量愈高的 DNA 分子，分子，Tm值也大。值也大。碱碱基基组组成成中中，由由于于 G-C 碱碱基基对对含含有有三三个个氢氢键键，A-T 碱碱基基对对只只有有两两个个氢氢键键，故故 G-C 对对比比 A-T 对
32、对牢牢固。固。（2）溶液的性质）溶液的性质 一一般般说说离离子子强强度度低低时时，Tm 值值较较低低，转转变变的的温温度度范范围围也也较较宽宽。反反之之，离离子子强强度度高高时时，Tm 值值较较高高，转转变变的的温温度度范范围围也也较较窄窄。所所以以DNA 的的制制品品不不应应保保存存在在极极稀稀的的电电解解质质溶溶液液中中，一一般般在在 1molL 溶溶液液中中保保存存较为稳定。较为稳定。3.5.4 核酸的杂交及应用核酸的杂交及应用分子杂交：分子杂交：即不同来源的多核苷酸链即不同来源的多核苷酸链间，经变性分离、退火处理后，若有互补间，经变性分离、退火处理后，若有互补的碱基顺序，就能发生杂交形
33、成的碱基顺序，就能发生杂交形成 DNA DNA 杂合体或杂合体或 DNA RNA 杂合体。杂合体。探针（探针（probe）：如果杂交的一条链是人工如果杂交的一条链是人工特定（已知核苷酸顺序）的特定（已知核苷酸顺序）的 DNA 或或 RNA 的序列，的序列，并经放射性同位素或其它方法标记，称为探针并经放射性同位素或其它方法标记，称为探针（probe）。）。通常利用杂交的方法，使通常利用杂交的方法，使“探针探针”与特定未知的序列发与特定未知的序列发生生“退火退火”形成杂合体，即可达到寻找和鉴定特定序列形成杂合体，即可达到寻找和鉴定特定序列的目的。的目的。3.6 核酸酶和核酸酶和DNA限制性内切酶限
34、制性内切酶3.6.1 核酸的酶促水解与核酸酶的分类核酸的酶促水解与核酸酶的分类3.6.2 核酸酶的特异性核酸酶的特异性3.6.3 限制性内切酶限制性内切酶3.7 DNA一级结构测定与一级结构测定与DNA的的 化学合成化学合成3.7.1 DNA 碱基顺序的测定碱基顺序的测定3.7.2 DNA 的化学合成的化学合成3.7.1 DNA 碱基顺序的测定碱基顺序的测定 DNA 顺序测定技术顺序测定技术 化学裂解法化学裂解法 和和 双脱氧核苷酸末端终止法。以双脱氧核双脱氧核苷酸末端终止法。以双脱氧核苷酸末端终止法最适用，又称苷酸末端终止法最适用，又称 Sanger 法。法。Sanger 法最突出的特点是在
35、法最突出的特点是在 PCR 反应中加入一种反应中加入一种 2，3-二脱氧核苷三磷酸（二脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。Sanger 法的程序法的程序 整个测定的程序如下：将被测整个测定的程序如下：将被测 DNA 制成单链模制成单链模板。分别加入板。分别加入 4 个反应管中。并在每个管中加入引个反应管中。并在每个管中加入引物、物、DNA 聚合酶聚合酶 和和 4 种种 dNTP（其中一种为其中一种为32P标记）标记）。然后在。然后在 1、2、3、4 个管中分别加入个管中分别加入 ddTTP、ddCTP、ddGTP 和和 ddATP。然后进行保温反应。然后进行保温反应。由于双脱氧的由于双脱氧的 ddN
36、TP 比正常的比正常的 dNTP 少了少了3-羟基，羟基，当它在当它在 DNA 聚合酶作用下掺入到正在延伸的聚合酶作用下掺入到正在延伸的 DNA 链时，因链时，因 ddNTP 不含不含 3-羟基，于是就阻止了其它羟基，于是就阻止了其它 dNTP 的继续掺入，起了特异性终止剂的作用。的继续掺入，起了特异性终止剂的作用。Sanger 法的结果分析法的结果分析 反应结束后在反应结束后在 4 个管中分别形成一些全部具有相个管中分别形成一些全部具有相同同 5-引物端、和分别以引物端、和分别以 ddT、ddC、ddG、ddA 残基残基为为 3-端结尾的一系列长短不一的混合物。端结尾的一系列长短不一的混合物
37、。每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射自显影，可见自显影，可见 4 种混合物形成不同的电泳迁移条带。种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表着一段以每一条带都代表着一段以 ddNTP 终止的片段。只要终止的片段。只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测 DNA 的的顺序。顺序。dATP+ddATPdGTP+ddGTPdCTP+ddCTPdTTPdTTP+ddTTPdCTPdGTPdATPdATPdCTPdTTPdTTPdGTPdATPdCTPdGTP1234-ATCGTddT-ATCGddT-AddT-A
38、TddC-ATCGTTddG-ATCddG-ATCGTTGddA-ddA35TAGCAACT5模板引物双脱氧法原理示意图管管管管引物延长和合成阻断电泳后的放射自显影直读图产物按长短排列：AGTTGCTA35-ATCGTTGddA-ATCGTTddG-ATCGTddT-ATCGddT-ATCddG-ATddC-AddT-ddATGCAATCGTTGA荧光标记3.8.1 基因基因 指导合成一种肽链的指导合成一种肽链的 DNA 片段即为片段即为一个基因。一个基因。3.8.2 基因组基因组 一个生物体的全部基因序列称为基因一个生物体的全部基因序列称为基因组（组（genome）。）。3.8 基因和基因组基因和基因组3.8.2 基因组基因组3.8.2.1 病毒基因组病毒基因组3.8.2.2 细菌基因组细菌基因组3.8.2.3 真核生物基因组真核生物基因组3.8.2.4 人类基因组计划人类基因组计划此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢