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1、微生物生理生化实验实验第1页，共15页，编辑于2022年，星期六一、教学目的与要求一、教学目的与要求 1 要求学生了解要求学生了解IMViC试验的原理及在肠道试验的原理及在肠道菌鉴定中的意义。菌鉴定中的意义。2 掌握掌握IMCiV及硫化氢试验的操作。及硫化氢试验的操作。教学时数：教学时数：6学时学时第2页，共15页，编辑于2022年，星期六二、二、试验原理试验原理 微生物体内各种酶系统控制的复杂多样的生化反应完微生物体内各种酶系统控制的复杂多样的生化反应完成成；测定微生物某些酶类的有无、对底物作用与否、；测定微生物某些酶类的有无、对底物作用与否、反应的条件、反应的产物及代谢方式都属于生理生反应
2、的条件、反应的产物及代谢方式都属于生理生化实验内容。化实验内容。在培养基内或在培养完成之后加入特定的指示剂就可确在培养基内或在培养完成之后加入特定的指示剂就可确定所发生的生理生化反应类型。定所发生的生理生化反应类型。常用的试验：糖代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、常用的试验：糖代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、氮源和碳源的利用试验及酶的试验等。氮源和碳源的利用试验及酶的试验等。第3页，共15页，编辑于2022年，星期六IMViC是四个生理生化反应英文词第一个字是四个生理生化反应英文词第一个字母的缩写，母的缩写，I表示吲哚试验（表示吲哚试验（indol test）、）、M表示甲基红试验（表示甲基
3、红试验（methyl red test）、）、V表示伏普反应（表示伏普反应（Voges-Proskauer reaction，小写之，小写之i使之成为一个可发音的使之成为一个可发音的单词）、单词）、C表示柠檬酸盐试验（表示柠檬酸盐试验（citrate test）。这四个试验在肠道细菌的鉴别中常）。这四个试验在肠道细菌的鉴别中常常作为一组常规生理生化试验来进行。常作为一组常规生理生化试验来进行。第4页，共15页，编辑于2022年，星期六1、吲哚试验（吲哚试验（indol test）含有色氨酸酶的细菌，能分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚（靛基质），吲哚本身没有颜色，不为肉眼所见，当加入对二甲氨基苯甲醛
4、试剂后，形成可见的红色化合物，即玫瑰吲哚 第5页，共15页，编辑于2022年，星期六2、甲基红试验（、甲基红试验（methyl red test）肠道细菌可分解葡萄糖产生丙酮酸，并使丙酮酸进一步分解为甲肠道细菌可分解葡萄糖产生丙酮酸，并使丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸等。对于一些细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等，发酸、乙酸、乳酸等。对于一些细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等，发酵葡萄糖产酸较多，使培养基酵葡萄糖产酸较多，使培养基pH下降到下降到4.2甚至更低，因此可用指甚至更低，因此可用指示剂甲基红（反应范围示剂甲基红（反应范围pH4.2红红6.3黄）指示出来。黄）指示出来。3、伏普反应（、伏普反应（V
5、oges-Proskauer reaction）产气杆菌能进行丁醇发酵，可使丙酮酸脱羧，生成中性的乙酰甲基甲产气杆菌能进行丁醇发酵，可使丙酮酸脱羧，生成中性的乙酰甲基甲醇（醇（3-羟基丁酮）可通过羟基丁酮）可通过V.P试验检测出来。在碱性条件下，乙酰甲试验检测出来。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇可被空气中的氧所氧化，生成二乙酰（丁二酮），二乙酰再与基甲醇可被空气中的氧所氧化，生成二乙酰（丁二酮），二乙酰再与蛋白质中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即为蛋白质中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即为V.P反应阳性。反应阳性。第6页，共15页，编辑于2022年，星期六第7页，共15页，编辑于2022年
6、，星期六柠檬酸盐培养基是合成培养基，不含蛋白胨和糖类，柠檬酸盐为唯一碳源。有的细菌如产气杆菌能利用柠檬酸钠作为碳源，柠檬酸钠为弱酸强碱盐，被分解利用后使培养基pH值升高，由中性变为碱性，可使培养基中的指示剂溴麝香草酚蓝（反应范围pH6.07.6，黄色蓝色）由绿变蓝。4、柠檬酸盐试验（、柠檬酸盐试验（citrate test）第8页，共15页，编辑于2022年，星期六三、实验器材三、实验器材恒温水浴锅，接种针，接种环，试管架，记号笔，滴管；蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐培养基（西蒙氏培养基）；甲基红试剂，V.P试剂，吲哚试剂，40%KOH溶液（内含0.3%肌酸），乙醚，6%-萘酚
7、酒精溶液；大肠杆菌，产气肠杆菌，枯草芽孢杆菌，普通变形杆菌。第9页，共15页，编辑于2022年，星期六四、实验步骤四、实验步骤 1、培养基制备培养基制备（略，已准备）：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐培养基2、培养基编号培养基编号3、接种：接种：按要求接种按要求接种4、培养：培养：37温箱中培养温箱中培养 5、生理生化反应及观察、生理生化反应及观察第10页，共15页，编辑于2022年，星期六（1）吲哚试验）吲哚试验培养后取出，先加入乙醚约培养后取出，先加入乙醚约1ml（使呈现明显的乙醚层），充分震（使呈现明显的乙醚层），充分震荡后沿试管壁缓缓滴加吲哚试剂荡后沿试管壁缓缓滴加吲哚试
8、剂5-10滴，观察有无红色环出现。滴，观察有无红色环出现。注意：加入吲哚试剂后不可再动摇注意：加入吲哚试剂后不可再动摇!有红色环出现者为阳性，有红色环出现者为阳性，反之为阴性反之为阴性（2）甲基红试验）甲基红试验取出培养物，在培养液中加入几滴甲基红试剂（约每毫升培养液取出培养物，在培养液中加入几滴甲基红试剂（约每毫升培养液加指示剂加指示剂1滴），立即观察结果，呈现红色为甲基红试验阳性，桔滴），立即观察结果，呈现红色为甲基红试验阳性，桔红色为弱阳性，桔黄或黄色为阴性反应。红色为弱阳性，桔黄或黄色为阴性反应。第11页，共15页，编辑于2022年，星期六（3）V.P反应试验反应试验 取出培养物取出培
9、养物2 ml，加入与培养基等量的，加入与培养基等量的V.P试剂，充分试剂，充分振荡，放置振荡，放置37温箱中温箱中30min，观察。呈红色者为阳性，观察。呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。不呈红色者为阴性。（4）柠檬酸盐的利用试验）柠檬酸盐的利用试验 取出培养物，观察，培养基上有菌苔生长且变为蓝取出培养物，观察，培养基上有菌苔生长且变为蓝色即为阳性反应；无菌生长、培养基仍为绿色者为色即为阳性反应；无菌生长、培养基仍为绿色者为阴性反应。凡阴性反应者，最好继续培养观察至第阴性反应。凡阴性反应者，最好继续培养观察至第7 d。第12页，共15页，编辑于2022年，星期六五、注意事项五、注意事项1.柠檬酸盐利用试验应防止琼脂中的杂质，同时制备培养基时应严格调节pH值。2.V.P反应要求在与空气充分接触下完成，因此加入试剂后须充分振摇。六、实验记录六、实验记录菌种吲哚试验MR试验V.P反应柠檬酸盐利用大肠杆菌产气杆菌变形杆菌第13页，共15页，编辑于2022年，星期六七、思考题七、思考题1.为什么说进行生理生化试验必须是纯培养？为什么说进行生理生化试验必须是纯培养？2.培养物中的吲哚是怎样产生的？又是通过什么培养物中的吲哚是怎样产生的？又是通过什么方法来测定的？方法来测定的？第14页，共15页，编辑于2022年，星期六第15页，共15页，编辑于2022年，星期六