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1、实验九实验九 细菌鉴定中常用的细菌鉴定中常用的 生生理生化反应理生化反应 4.Inspection 观察观察5.Identification 鉴定鉴定2.Incubation 培养培养3.Isolation 分离分离FIVE IS1.Inoculation 接种接种一一、实验目的、实验目的学习检测微生物代谢特性的试验方法掌握 淀粉水解试验 糖发酵试验 吲哚试验 VP试验 石蕊牛乳试验 的反应原理及操作二二、实验原、实验原理理 同种的细菌具有相同或相近的表型特征（形态、同种的细菌具有相同或相近的表型特征（形态、生理特征、代谢产物等），而细菌的生理特征，主生理特征、代谢产物等），而细菌的生理特征，
2、主要取决于酶的催化作用，但各种细菌具有不同的酶要取决于酶的催化作用，但各种细菌具有不同的酶系统，从而导致系统，从而导致代谢类型的多样性代谢类型的多样性。在所有生活细胞中存在的这些化学反应被称为在所有生活细胞中存在的这些化学反应被称为生理生化反应（酶促反应生理生化反应（酶促反应）。）。人们在微生物的分类鉴定工作中，人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生常利用其生理生化反应作为重要的分类依据。理生化反应作为重要的分类依据。三、实验材料三、实验材料1.实验菌种：实验菌种：枯草杆菌（枯草杆菌（BS）、大肠杆菌）、大肠杆菌（EC）2培养培养基：（基：（2人为一组）人为一组）淀粉培养基（固体）：淀粉培养
3、基（固体）：1皿皿/人人糖发糖发酵管酵管(乳糖、葡萄糖、蔗糖各乳糖、葡萄糖、蔗糖各2只）：只）：6支支/组组蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基：4支支/组组葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基：4 4支支/组组石蕊牛乳培养基：石蕊牛乳培养基：2支支/组组3实验开始前分别标记好每一组试管，一半为实验开始前分别标记好每一组试管，一半为BS，一半为，一半为EC。四、实验内容四、实验内容1.淀粉水解淀粉水解试验（原理：淀粉遇碘变蓝）试验（原理：淀粉遇碘变蓝）细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的
4、过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。（1）倒平板，凝固后在培养皿底面两侧的中央位置分别标记BS或EC。（2）用接种环以点接的方式接上菌种。一边接枯草杆菌BS，另一边接大肠杆菌EC。（3）将接完种的平板倒置于37恒温培养箱，培养7。（4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以“+”、“”表示有无透明圈）具体操作：具体操作：2.糖类发酵试验（含碳化合物的分解利用糖类发酵试验（含碳化合物的分解利用）原理及现象：原理及现
5、象：不同糖类经不同代不同糖类经不同代谢途径分解后可产谢途径分解后可产生有机酸，气体或生有机酸，气体或二者都有，借助于二者都有，借助于溴甲酚紫显色溴甲酚紫显色溴甲酚紫显色溴甲酚紫显色。指示剂：溴甲酚紫（变色范围指示剂：溴甲酚紫（变色范围pH5.2-6.8,pH6.8紫色）紫色）pH5.2,溶液由清亮紫色变为浑浊黄色溶液由清亮紫色变为浑浊黄色 乳酸、醋酸、丙酸乳酸、醋酸、丙酸葡萄糖葡萄糖/乳糖乳糖甲烷、氢、二氧化碳甲烷、氢、二氧化碳杜氏小管内有气泡，产气漂浮杜氏小管内有气泡，产气漂浮（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌BS或大肠杆菌EC于葡萄糖、蔗糖、乳糖商品化发酵管中。以未接种的作为对照（全班
6、1-2支试管即可）。（2）接种后置于37恒温培养箱，培养7d。（3）观察结果时，看各管颜色变化及小管顶部有无气泡。产酸产气用产酸产气用“”表示；只产酸不表示；只产酸不产气用产气用“+”表示；不产酸也不产气表示；不产酸也不产气用用“-”表表示。示。具体操作：具体操作：色色色色氨酸氨酸氨酸氨酸吲哚吲哚吲哚吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚 吲哚吲哚吲哚吲哚试剂试剂试剂试剂 -+3.吲哚吲哚（indole）试验：（试验：（含含氮化合物的氮化合物的分解利用分解利用）（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于蛋白胨水培养基中。（2）接种后置于37恒温培养箱，培养7d。以未接种的作为对照（全班1
7、-2支试管即可）。（3）观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈明显的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色。（注意：注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。以“+”、“”表示有无红色的玫瑰吲哚。具体操作：具体操作：4.VP实验实验 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养葡萄糖蛋白胨水培养基基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应）反应。2CH3COCOOH2CH3COCOOH C
8、H3COCHOHCH3 CH3COCHOHCH3十十2CO22CO2 丙酮酸丙酮酸 乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇CH3COCHOHCH3 CH3COCOCH3CH3COCHOHCH3 CH3COCOCH3乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 NaOHNaOH 丁二酮（二乙酰）丁二酮（二乙酰）v取出塞子，取出塞子，加加10滴滴VP试剂，振荡混合后，试剂，振荡混合后，置沸水浴中保温，置沸水浴中保温，5分钟后观察实验结果。分钟后观察实验结果。出现红色这位出现红色这位VP试验阳性。试验阳性。v接种及培养方式如同吲哚实验接种及培养方式如同吲哚实验具体操作：具体操作：5.石蕊牛乳试验：（利用蛋白质酪素的能力）石蕊牛乳试验
9、：（利用蛋白质酪素的能力）牛乳的主要成分为乳糖，蔗糖，蛋白质和酪素等成分。牛乳中加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原的指示剂（中性为黄色中性为黄色，酸性为红色酸性为红色，碱性为蓝色，石蕊被还原时，则部分或全部脱色）。由于各种细菌对牛乳的利用不同，引起培养基的变化也就不同，主要变化为：酸凝：酸凝：主要从乳糖产生酸，指示剂变红色。pH4.7以下时，有牛乳的凝固；如有气体形成，则凝块中有裂隙。凝乳酶凝固作用：凝乳酶凝固作用：很少或无酸产生，分泌凝乳酶使牛乳凝固。细菌产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨，使培养基的pH进一步升高，呈深蓝紫色。胨化：胨化：酪蛋白被水解，部分或大部分牛奶变清亮。可在酸性或碱性条
10、件下进行，石蕊被还原脱色。（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于石蕊牛乳培养基中。（2）接种后置于37恒温培养箱，培养7-14d。（3）观察结果时，看各管颜色变化及牛乳胨化的现象。具体操作：具体操作：五、实验报告五、实验报告1细菌对各种生理生化试验反应的结果：细菌对各种生理生化试验反应的结果：淀粉淀粉水解水解试验试验糖发酵试验糖发酵试验吲哚吲哚试验试验VP试验试验石蕊石蕊牛乳牛乳试验试验乳糖乳糖葡萄糖葡萄糖蔗糖蔗糖枯草枯草杆菌杆菌大肠大肠杆菌杆菌菌种名称（1）淀粉等生物大分子物质能否不经分解而直接被细菌吸收？为什么？（2）假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？（3）解释在细菌培养中吲哚试验的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？2.思考题思考题