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1、关于酶工程第十节酶与现代生命科学第一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 一、一、酶是分子生物学研究的重要工具酶是分子生物学研究的重要工具 酶是分子生物学研究的重要工具。酶是分子生物学研究的重要工具。特别是限制性核酸内特别是限制性核酸内切酶切酶的发现提供了特异剪切的发现提供了特异剪切DNADNA的工具的工具,促进了促进了DNADNA重组技术诞重组技术诞生生,推动了基因工程发展推动了基因工程发展,成为分子生物学研究的不可缺少的成为分子生物学研究的不可缺少的工具工具.Hind 的识别序列和切割位点的识别序列和切割位点 5-GTPy PU AC -3 3-CAPU Py TG -5 第二张，P
2、PT共五十一页，创作于2022年6月 限制性内切酶在基因工程中的应用限制性内切酶在基因工程中的应用 基因工程基因工程基因工程基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、），也叫基因操作、遗传工程，或重组体遗传工程，或重组体DNA技术。它是根据人们预先设想，技术。它是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再将重组子转化到适当受体细胞适宜的载体上组成重组子，再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞的目的的技术。中进行扩增表达，以达到改造生物细胞的目
3、的的技术。基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。前者主计构建和基因产物的生产两大部分组成。前者主要在实验室里进行，其单元操作过程如下：要在实验室里进行，其单元操作过程如下：第三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月第四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 基因工程的单元操作过程如下：基因工程的单元操作过程如下：（1 1）从供体细胞中分离出基因组）从供体细胞中分离出基因组DNADNA，用限制性，用限制性核酸内切酶分别将外源核酸内切酶分别将外源DNADNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切（包括外源基因或目的基
4、因）和载体分子切开。开。（2 2）用）用DNADNA连接酶将含有外源基因的连接酶将含有外源基因的DNADNA片段接到片段接到 载体分子上，形成载体分子上，形成DNADNA重组分子。重组分子。（3 3）借助于细胞转化手段将）借助于细胞转化手段将DNADNA重组分子导入受重组分子导入受 体细胞中。体细胞中。（4 4）短时间培养转化细胞，以扩增）短时间培养转化细胞，以扩增DNADNA重组分子重组分子 或使其整含到受体细胞的基因组中。或使其整含到受体细胞的基因组中。（5 5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高 效稳定表达的基因工程菌或细胞。效稳定表达的基因工程菌
5、或细胞。第五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 关于限制性内切酶关于限制性内切酶 Restriction endonueleases 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链别双链DNADNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。脱氧核糖核酸水解酶。主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到10001000种种以上，搞清识别序列的有以上，搞清识别序列的有300300种以上。种以上。第六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 有关限制性内切酶发现的
6、几个重要实验有关限制性内切酶发现的几个重要实验 5050年代初，年代初，LuriaLuria和和HumanHuman在研究在研究T4T4噬菌体感染作用、噬菌体感染作用、BertaniBertani和和WeigleWeigle在研究在研究 和和P2P2噬菌体与宿主细胞关系时，噬菌体与宿主细胞关系时，发现了细菌内限制与修饰现象。发现了细菌内限制与修饰现象。发现了细菌内存在限制修饰系统，在这两个系统中包发现了细菌内存在限制修饰系统，在这两个系统中包括限制酶和修饰酶。限制酶能识别并降解与自身无关的外括限制酶和修饰酶。限制酶能识别并降解与自身无关的外源源DNADNA，而修饰酶则可通过甲基化修饰自身，而修
7、饰酶则可通过甲基化修饰自身DNADNA，免被限，免被限制酶降解。制酶降解。第七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月Bertani和和Weigle大肠杆菌噬菌体感染实验大肠杆菌噬菌体感染实验Bertani和和Weigle在探索在探索 和和P2噬菌体噬菌体与宿主细胞关与宿主细胞关系时，均提出系时，均提出了了噬菌体感噬菌体感染大肠杆菌染大肠杆菌后，宿主细后，宿主细胞对入侵的胞对入侵的噬菌体噬菌体DNA表表现有特异的限现有特异的限制作用。制作用。CEcoli.CEcoli.CEcoli.K12大量繁殖受到抑制第八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月Meselson和和Yuan实验实验噬菌体
8、噬菌体 K12和和 C的的DNA分别与分别与由由K12菌体制菌体制备的细胞抽备的细胞抽提物保温，提物保温，并藉蔗糖密并藉蔗糖密度梯度离心度梯度离心观察两种观察两种DNA沉降速沉降速度的变化。度的变化。K12 DNA C DNA加入加入K12K12菌体制备的细胞菌体制备的细胞抽提物抽提物蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心第九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 实验表明，这种限制的本质是宿主细胞实验表明，这种限制的本质是宿主细胞K12中中存在有能使外来存在有能使外来DNA(CDNA)有限降解的核有限降解的核酸水解酶。酸水解酶。此后，又进一步证实了大肠杆菌此后，又进一步证实了大肠杆菌K12中的
9、修饰中的修饰体系即为甲基化酶，该酶修饰了体系即为甲基化酶，该酶修饰了 K12 DNA上上的特异部位，使其不被限制体系的酶切割。的特异部位，使其不被限制体系的酶切割。结论表明：结论表明：第十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月n1965年年阿尔伯阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶。并于切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分年成功分 离出离出I型型限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在两种不同功能但又相限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在两种不同功能但又相关的酶。关的酶。n1970年年史密斯从史密斯从流
10、感噬血杆菌流感噬血杆菌d株中株中分离出了分离出了II型限制性内切型限制性内切酶；同年酶；同年内森斯内森斯使用该酶降解猕猴肿瘤病毒使用该酶降解猕猴肿瘤病毒SV40的的DNA，首，首次完次完 成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从此成为分子克隆技术成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从此成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶，推动了基因工程的发展。中不可缺少的工具酶，推动了基因工程的发展。n1978年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔奖。年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔奖。第十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月阿尔伯阿尔伯(1929)瑞士微生物遗传学瑞士微生物遗传学家家 H.
11、O.史密斯史密斯(1931)美美国分子生物学家、遗国分子生物学家、遗传学家传学家 内森斯内森斯(1928)美国美国微生物遗传学家微生物遗传学家 第十二张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 限制性内切酶限制性内切酶命名规则命名规则 限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母即由其属名的第一个字母(大写大写)与种名的第一、二两与种名的第一、二两个字母个字母(小写小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌有株系组成酶的基本命名，若酶的产生菌有株系之分，则有之分，则有4个或个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字个以上拉丁字母组成，其第四个字
12、母之后表示株系。母之后表示株系。如如 EcoRI来源于来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于来源于B.amyloliquefaciens第十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月H in d IIHaemophilus(属名属名)Influenzae(种名种名)d(株系株系)罗马数字罗马数字限限制制性性内内切切酶酶命命名名举举例例第十四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 限制性内切酶分类限制性内切酶分类 已发现的限制酶可以分为三类或称作三已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：型：I、II、III型。他们在酶反应中所需要的型。他们在酶反应中所需要的辅因子辅
13、因子和和切割切割DNA的位点的位点都不相同，而且酶蛋都不相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。白分子的大小和组成上也有差别。第十五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 类别反应必须因子专一性 活性 I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+识别部位和切点不同，无特定切割位点内切甲基化 II型Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位只有限制酶活性 III型ATP，Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位内切甲基化限制性内切酶分类限制性内切酶分类第十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月第十七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 二、二、II 型限制性内切酶的特性型限制性内切酶
14、的特性 II型限制酶的识别特异性型限制酶的识别特异性 回文识别序列回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构双重对称结构性结构,或称回文序列或称回文序列 (Palindromic Sequence)第十八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 非典型回文识别序列非典型回文识别序列 回文识别序列被一至几个其他核苷酸（回文识别序列被一至几个其他核苷酸（N）所）所间隔，得到的是非典型的双轴对称性序列间隔，得到的是非典型的双轴对称性序列。Bgl I GCCNNNN NGGCMst II CC TNAGG第十九张，PPT共五十一页，创作于2022年
15、6月 非回文识别序列非回文识别序列 也有些限制酶识别序列非回文结构，切割位也有些限制酶识别序列非回文结构，切割位点在距识别序列点在距识别序列5至至13个个bp处。处。5 GACGCNNNNN 33 CTGCGNNNNNNNNNN 5例：例：Hgn I GACGC第二十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 有些限制酶可识别多重序列。如：有些限制酶可识别多重序列。如：Hind II，识别序列为，识别序列为GTPyPuAC，可识别，可识别三三三三种序列。种序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）类似的内切酶还有类似的
16、内切酶还有 Acc I、Ava I、Ban I、Hae I 等，它们的特等，它们的特异性低于单一识别序列的酶。异性低于单一识别序列的酶。第二十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 识别序列的长度与剪切频率识别序列的长度与剪切频率 大部分大部分II型限制性内切酶的识别序列长度为型限制性内切酶的识别序列长度为4-8个核苷个核苷酸。识别长度决定了剪切酸。识别长度决定了剪切DNA的频率（的频率（1/4n，n为识别的长度）为识别的长度）。识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性高。高。第二十二张，PPT共五十一页，创作于2022年6
17、月 限制酶的切割特异性和限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构酶切片段的末端结构 切割位点专一切割位点专一 作为工具酶的作为工具酶的限制性内切酶限制性内切酶有固定的切割位点；有固定的切割位点；产物具有特定的末端结构产物具有特定的末端结构 当一个当一个DNA分子被限制酶切开后形成两个末端，全部产物具分子被限制酶切开后形成两个末端，全部产物具有相同的末端结构。即一种限制性内切酶切割任何有相同的末端结构。即一种限制性内切酶切割任何DNA只产生一只产生一种固定形式的末端结构，种固定形式的末端结构，在在DNA连接酶的作用下，磷酸二酯键连接酶的作用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的可以修复而成为一个重
18、组的DNA分子；而不同限制酶则形成不分子；而不同限制酶则形成不同末端结构。同末端结构。5-G3-CTTAA +AATTC-3 G-55-GAATTC-33-CTTAAG-5 DNADNA连接酶连接酶5-GAATTC-33-CTTAAG-5第二十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 任何一种任何一种限制酶切割限制酶切割DNA链时，总是水解核苷酸链时，总是水解核苷酸 3、5-磷酸双酯键的磷酸双酯键的3位磷酸酯键，使产物的位磷酸酯键，使产物的5端带磷端带磷 酸单酯基团，而酸单酯基团，而3为游离羟基。为游离羟基。由于切割位点不同，由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构所有的限制酶可产
19、生两类末端结构 平末端平末端（Blunt End）指酶切片段为齐头末端结构）指酶切片段为齐头末端结构。粘性末端粘性末端（Cohesive End）酶切后）酶切后DNA片段末端带有片段末端带有 1-4个核苷酸残基长度的单链结构个核苷酸残基长度的单链结构，而片段，而片段 两端突出的单链具有互补的序列。两端突出的单链具有互补的序列。粘性末端又可分为粘性末端又可分为 5-粘性末端粘性末端与与 3-粘性末端。粘性末端。5 NOH 3 5PO4N 3第二十四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月第二十五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月粘性末端粘性末端3-粘性末端粘性末端5-粘性末端粘性末端平
20、末端平末端 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 EcoR I 5-G AATTC-33-CTTAA G-5 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Pst I5-CTGCA G-33-G ACGTC-5 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 Sma I5-CCC GGG-33-GGG CCC-5第二十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 有没有例外？有没有例外？（1 1）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段A）含多重识别序列的限制酶含多重识别序列的
21、限制酶 如如 Hind II Hind II 在顺序在顺序GTPyPuAC 剪切，可产生剪切，可产生3种不同种不同 类型片段，互相连接的可能性为类型片段，互相连接的可能性为 1/3。B）含非典型识别序列的限制酶含非典型识别序列的限制酶 如如 EcoN I 在顺序在顺序CCTNNNNNAGC 剪切，剪切，N可以是任何核可以是任何核 苷酸，由于苷酸，由于N的随意性，往往会产生不广泛匹配的片段。的随意性，往往会产生不广泛匹配的片段。C）在次理想条件下，限制酶表现出在次理想条件下，限制酶表现出星状活性星状活性，影响正常匹配。，影响正常匹配。第二十七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月（2）不同的
22、限制性内切酶）不同的限制性内切酶有时有时可以产生匹配的片段可以产生匹配的片段可以产生匹配的片段可以产生匹配的片段 例：例：BamH I G GATCCBcl I T GATCABgl II A GATCT 这类能产生相同粘性末端而识别特异性不同的限制酶称作这类能产生相同粘性末端而识别特异性不同的限制酶称作同尾限同尾限制酶制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶产生的）。同尾限制酶产生的DNA片段可借片段可借DNA连接酶连接酶互相重组，但新产生的杂合序列将不再被原有的限制酶所识别。互相重组，但新产生的杂合序列将不再被原有的限制酶所识别。5-G GATCT-3 DNA 5-GGATCT-3 3
23、-CCTAG A-5 连接酶连接酶 3-CCTAGA-5(BamH I 片段片段)(Bgl II 片段片段)(产生杂合识别序列产生杂合识别序列)第二十八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 酶反应条件酶反应条件酶反应条件酶反应条件 按手册或商品说明书按手册或商品说明书 反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。常用的缓冲液选择常用的缓冲液选择 Tris-Hcl。同时还。同时还 要加入要加入 Mgcl2 和和 2-巯基乙醇巯基乙醇。反应温度：反应温度：一般限制性内切酶的反应温度是一般限制性内切酶的反应温度是 37c。酶活性单位：酶活性单位：
24、1个酶活性单位是指一种酶在其最适宜的个酶活性单位是指一种酶在其最适宜的 反应条件下，反应条件下，1小时使小时使 1g 噬菌体噬菌体DNA 底物完全水解的酶量。但由于许多因素可底物完全水解的酶量。但由于许多因素可 影响内切酶的水解反应和用量，实际用量影响内切酶的水解反应和用量，实际用量 需比所需用量需比所需用量多加一倍多加一倍左右。左右。第二十九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 第二活性第二活性 在次理想条件下在次理想条件下,一些限制性内切酶的特异型会被降低一些限制性内切酶的特异型会被降低,只只有部分正常识别位置被识别有部分正常识别位置被识别,此称为此称为第二活性第二活性（Second
25、ary Activity），也称星号活性（），也称星号活性（Star Activity），加以），加以“*”表示，表示，如如 EcoR I*。酶的第二活性将引起底物。酶的第二活性将引起底物DNA链上切口增多，酶链上切口增多，酶解片断变小，造成特异性降低。解片断变小，造成特异性降低。例：理想条件下例：理想条件下 （PH=7.5）EcoR I G AATTC 次理想条件下次理想条件下（PH=8.5）EcoR I*AATT次理想条件次理想条件：通常包括不适合的离子强度、过高的：通常包括不适合的离子强度、过高的PH、二价金属离子的替换、较高的甘油浓度等。二价金属离子的替换、较高的甘油浓度等。第三十张，
26、PPT共五十一页，创作于2022年6月 限制酶的保质期限制酶的保质期 一般是在检定日以后的一年内，但几乎所有一般是在检定日以后的一年内，但几乎所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失活的限制酶在超过保质期后都不会急剧失活,因此因此购入后即使是经过长时间保存的酶购入后即使是经过长时间保存的酶,也完全可以使也完全可以使用，但这些酶在使用前最好再测一次活性。用，但这些酶在使用前最好再测一次活性。另外，保存酶时即便让其冻结，大部分酶也另外，保存酶时即便让其冻结，大部分酶也不会急剧失活。不会急剧失活。第三十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月EcoRI第三十二张，PPT共五十一页，创作于2022年
27、6月PstI第三十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月SmaI return第三十四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 研究酶的理化性质及其作用原理，对于阐明生命研究酶的理化性质及其作用原理，对于阐明生命现象的本质和规律具有十分重要的意义（包括酶的现象的本质和规律具有十分重要的意义（包括酶的结构功能、酶与代谢调节、酶与生物的生长、发育、结构功能、酶与代谢调节、酶与生物的生长、发育、进化、疾病等）进化、疾病等）。从酶分子水平去探讨酶与生命活动、与代谢调节、从酶分子水平去探讨酶与生命活动、与代谢调节、与疾病、生长发育等等的关系，对阐明某些生命活动与疾病、生长发育等等的关系，对阐明某
28、些生命活动的本质和规律，无疑也具有十分重要的意义。的本质和规律，无疑也具有十分重要的意义。二、酶是生命科学研究的重要对象二、酶是生命科学研究的重要对象第三十五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 同功酶同功酶n同工酶同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，而酶蛋是指催化的化学反应相同，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶,存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。一组织或细胞中。n目前已发现有目前已发现有150150多种
29、酶具有同工酶多种酶具有同工酶，如，如6-6-磷酸葡萄磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸酶、谷糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核丙转氨酶和谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、过氧化酶和胆碱酯酶等。其中，发现最早，酸酶、过氧化酶和胆碱酯酶等。其中，发现最早，研究最多的是乳酸脱氢酶（研究最多的是乳酸脱氢酶（LDHLDH）同工酶）同工酶.第三十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月例：例：LDHLDH同工酶的两种亚基以不同比例组成五种四聚体：同工酶的两种亚基以不同比例组成五种四聚体：LDH1(H4)LDH1(H4)、LDH2(H3M)
30、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)LDH4(HM3)和和LDH5(M4)LDH5(M4)。Dogfish LDH M4结构图 第三十七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 同功酶与物种进化同功酶与物种进化 同工酶是生物进化过程中为适应愈趋复同工酶是生物进化过程中为适应愈趋复杂的代谢而引起的一种分子进化，以适应不杂的代谢而引起的一种分子进化，以适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要.同功酶在各器官和组织中的分布不同。同功酶在各器官和组织中的分布不同。这样就可以这样就可以根据同工酶酶谱差异并配合其它根据同工
31、酶酶谱差异并配合其它方法从分子水平探讨物种进化、遗传变异等方法从分子水平探讨物种进化、遗传变异等一些生命现象。一些生命现象。第三十八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 在正常情况下血清中同功酶谱是相对稳定的。在正常情况下血清中同功酶谱是相对稳定的。当某一组织或器官发生病变时，就有某种特殊当某一组织或器官发生病变时，就有某种特殊的同工酶释放出来，引起血清中同功酶活性的的同工酶释放出来，引起血清中同功酶活性的改变。对病人及正常人同工酶电泳图谱进行比改变。对病人及正常人同工酶电泳图谱进行比较，有助于上述器官疾病的诊断。较，有助于上述器官疾病的诊断。在临床上已应用同工酶做诊断指标在临床上已应用
32、同工酶做诊断指标,例如例如:冠心病及冠状动脉血栓冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损者血清中引起的心肌受损者血清中LDH(H4)LDH(H4)及及LDH2(MH3)LDH2(MH3)含量增高含量增高;而肝细胞受损而肝细胞受损患者血清中患者血清中LDH5(M4)LDH5(M4)增高。增高。第三十九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 同功酶与其它同功酶与其它 同工酶的研究不仅在临床血液病、同工酶的研究不仅在临床血液病、肿瘤及其它疾病的诊断方面占有重要肿瘤及其它疾病的诊断方面占有重要地位，而且在地位，而且在分子遗传学、物种鉴定、分子遗传学、物种鉴定、法庭取证、亲子鉴定、优生优育法庭取证、亲子鉴
33、定、优生优育等领等领域中也具有广阔的应用前景。域中也具有广阔的应用前景。第四十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 肿瘤的酶异常肿瘤的酶异常 肿瘤酶异常原因：肿瘤酶异常原因：1 1、肿瘤过多或过少产生酶、肿瘤过多或过少产生酶2 2、肿瘤阻塞了酶通过的导管系统、肿瘤阻塞了酶通过的导管系统3 3、肿瘤诱导酶产生、肿瘤诱导酶产生4 4、细胞通透性改变使可溶性酶进入血液循环、细胞通透性改变使可溶性酶进入血液循环 第四十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 临床诊断还没有单一指标可确诊癌，临床诊断还没有单一指标可确诊癌，所以酶测定可作为一种辅助手段，如：所以酶测定可作为一种辅助手段，如：n
34、测定血清淀粉酶测定血清淀粉酶胰腺癌胰腺癌n酸性磷酸酶酸性磷酸酶前列腺癌前列腺癌n亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脱氢酶等同工酶谱亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脱氢酶等同工酶谱变化变化肝癌、结肠癌、直肠癌。肝癌、结肠癌、直肠癌。第四十二张，PPT共五十一页，创作于2022年6月端粒酶端粒酶 l端粒、端粒酶与肿瘤发生的关系是近年端粒、端粒酶与肿瘤发生的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一。有研究表来肿瘤研究领域的热点之一。有研究表明明,端粒酶在端粒酶在85%95%的恶性肿瘤的恶性肿瘤组织中有阳性表达组织中有阳性表达,而在正常体细胞则而在正常体细胞则一般为阴性。因此端粒酶抑制剂的研究一般为阴性。因此端粒酶抑
35、制剂的研究为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计及基为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计及基因治疗开辟了一个新的途径。因治疗开辟了一个新的途径。第四十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 端粒端粒(telomere)(telomere)l真核细胞染色体末端以真核细胞染色体末端以 TTAGGGTTAGGG 6 6个碱基序列重复个碱基序列重复组成的组成的DNADNA结构结构l人体细胞染色体端粒长度约为人体细胞染色体端粒长度约为5 515Kb,15Kb,其功能在于其功能在于保保护染色体免受核酶降解护染色体免受核酶降解,防止断端融合重排或降解。防止断端融合重排或降解。如果端粒长度缩短到极限如如果端粒长度缩短
36、到极限如4Kb4Kb以下时以下时,细胞则会丧失细胞则会丧失分裂增殖能力而发生凋亡分裂增殖能力而发生凋亡,该过程称为监控点激活该过程称为监控点激活(checkpoint activation)(checkpoint activation)。l端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子信端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子信号号,端粒被称为细胞寿命的端粒被称为细胞寿命的“分裂钟分裂钟”。第四十四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月端粒的保护机制端粒的保护机制 在真核细胞在真核细胞,端粒端粒DNA的富的富G链较富链较富C链超出链超出约约1216bp,形成形成3端的突出单链结构端的突出单链结构
37、,而而端粒蛋白质能够特异地识别这一突出区域并端粒蛋白质能够特异地识别这一突出区域并与之结合与之结合,再通过进一步的折叠、盘曲再通过进一步的折叠、盘曲,从而从而形成染色体末端具有保护功能的形成染色体末端具有保护功能的“帽子帽子”,在防止染色体互相融合、重组等方面都发挥在防止染色体互相融合、重组等方面都发挥着十分重要的作用着十分重要的作用 第四十五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月第四十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月端粒酶端粒酶(telomerase)(telomerase)l依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶,其实质是一种核糖核蛋白酶其实质是一种核糖核蛋白酶(
38、ribonucleo protein,RNP),(ribonucleo protein,RNP),能识别特定的端粒重能识别特定的端粒重复序列复序列,以自身以自身RNARNA的部分序列的部分序列(5-CUAACCCUAAC-(5-CUAACCCUAAC-3)3)为模板为模板,合成新的端粒重复序列合成新的端粒重复序列,使端粒延长。使端粒延长。l是已知的恶性肿瘤特异性最强的生物标志物。是已知的恶性肿瘤特异性最强的生物标志物。l也表达于生殖细胞、造血干细胞等非肿瘤细胞中。也表达于生殖细胞、造血干细胞等非肿瘤细胞中。第四十七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月医疗新途径医疗新途径 美国美国Gero
39、n公司的研究者已经表明成熟的癌公司的研究者已经表明成熟的癌细胞具有端粒酶细胞具有端粒酶,使得它们逃脱了衰老法则。美使得它们逃脱了衰老法则。美国国Geron公司希望能够通过抑制端粒酶的活性来对癌公司希望能够通过抑制端粒酶的活性来对癌细胞发起攻击细胞发起攻击,或者是制造一种病毒或者是制造一种病毒,该病毒能够杀该病毒能够杀死表达端粒酶的癌细胞死表达端粒酶的癌细胞,但是对于正常的细胞却没但是对于正常的细胞却没有影响。有影响。第四十八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 针对端粒酶活性的肿瘤治疗针对端粒酶活性的肿瘤治疗阻断人端粒酶阻断人端粒酶RNA的模板作用抑制端粒酶的模板作用抑制端粒酶人为促使端
40、粒酶人为促使端粒酶RNA突变突变抑制端粒酶催化亚单位抑制端粒酶催化亚单位(hTRET)核苷类似物竞争性抑制反转录过程核苷类似物竞争性抑制反转录过程细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性蛋白激酶抑制剂对端粒酶活性的调节蛋白激酶抑制剂对端粒酶活性的调节通过底物通过底物端粒调节端粒酶活性端粒调节端粒酶活性其它抑制剂对端粒酶活性的调节其它抑制剂对端粒酶活性的调节第四十九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 问题问题端粒酶抑制剂要作为一种肿瘤治疗药物端粒酶抑制剂要作为一种肿瘤治疗药物应用于临床应用于临床,仍有很多问题有待解决仍有很多问题有待解决:(1)(1)端粒酶活性调节的确切机
41、制还不清楚端粒酶活性调节的确切机制还不清楚,不同的抑制剂不同的抑制剂对同一种细胞或同一种抑制剂对不同的细胞的抑制对同一种细胞或同一种抑制剂对不同的细胞的抑制作用都不相同作用都不相同,如何针对不同的肿瘤选择最有效的抑如何针对不同的肿瘤选择最有效的抑制剂还需进一步研究。制剂还需进一步研究。(2)(2)除在大多数肿瘤中检测到端粒酶活性外除在大多数肿瘤中检测到端粒酶活性外,在正常人在正常人体有自我更新能力的细胞中如睾丸与卵巢生殖细体有自我更新能力的细胞中如睾丸与卵巢生殖细胞系、子宫内膜细胞、增生的表皮基底细胞、造胞系、子宫内膜细胞、增生的表皮基底细胞、造血细胞同样观察到高低不同的端粒酶活性血细胞同样观察到高低不同的端粒酶活性,端粒酶端粒酶的抑制势必会对这些细胞产生副作用的抑制势必会对这些细胞产生副作用,所以端粒酶所以端粒酶抑制剂的毒性评价也是一个非常重要的问题。抑制剂的毒性评价也是一个非常重要的问题。第五十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第五十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月