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1、 一、一、酶是分子生物学研究的重要工具酶是分子生物学研究的重要工具 酶是分子生物学研究的重要工具。酶是分子生物学研究的重要工具。特别是限制性特别是限制性核酸内切酶核酸内切酶的发现提供了特异剪切的发现提供了特异剪切DNADNA的工具的工具, ,促进了促进了DNADNA重组技术诞生重组技术诞生, ,推动了基因工程发展推动了基因工程发展, ,成为分子生物成为分子生物学研究的不可缺少的工具学研究的不可缺少的工具. . Hind 的识别序列和切割位点的识别序列和切割位点 5 - GTPy PU AC - 3 3 - CAPU Py TG - 5 （genetic engineering），也叫基因操），
2、也叫基因操作、遗传工程，或重组体作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是根据人们技术。它是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞的目的的技术。达到改造生物细胞的目的的技术。 基因工程的整个过程由工程菌（细胞）基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。前者主要在实验室里进行，其单元
3、操作过程前者主要在实验室里进行，其单元操作过程如下：如下： 基因工程的单元操作过程如下：基因工程的单元操作过程如下：（1 1）从供体细胞中分离出基因组）从供体细胞中分离出基因组DNADNA，用限制性，用限制性核酸内切酶分别将外源核酸内切酶分别将外源DNADNA（包括外源基因或目的基因）和载（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开。体分子切开。 （2 2）用）用DNADNA连接酶将含有外源基因的连接酶将含有外源基因的DNADNA片段接到片段接到 载体分子上，形成载体分子上，形成DNADNA重组分子。重组分子。（3 3）借助于细胞转化手段将）借助于细胞转化手段将DNADNA重组分子导入受重组分子导
4、入受 体细胞中。体细胞中。（4 4）短时间培养转化细胞，以扩增）短时间培养转化细胞，以扩增DNADNA重组分子重组分子 或使其整含到受体细胞的基因组中。或使其整含到受体细胞的基因组中。（5 5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高 效稳定表达的基因工程菌或细胞。效稳定表达的基因工程菌或细胞。 关于限制性内切酶关于限制性内切酶 Restriction endonueleases 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链类能识别双链DNADNA中特定核苷酸序列并具有专一切中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核
5、糖核酸水解酶。割位点的脱氧核糖核酸水解酶。 主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到10001000种以上，搞清识别序列的有种以上，搞清识别序列的有300300种以上。种以上。 有关限制性内切酶发现的几个重要实验有关限制性内切酶发现的几个重要实验 5050年代初，年代初，LuriaLuria和和HumanHuman在研究在研究T4T4噬菌体感噬菌体感染作用、染作用、BertaniBertani和和WeigleWeigle在研究在研究 和和P2P2噬菌体与宿噬菌体与宿主细胞关系时，发现了细菌内限制与修饰现象。主细胞关系时，发现了细菌内限制与修饰现象。 发现了细菌内
6、存在限制修饰系统，在这两个系发现了细菌内存在限制修饰系统，在这两个系统中包括限制酶和修饰酶。限制酶能识别并降解与统中包括限制酶和修饰酶。限制酶能识别并降解与自身无关的外源自身无关的外源DNADNA，而修饰酶则可通过甲基化修，而修饰酶则可通过甲基化修饰自身饰自身DNADNA，免被限制酶降解。，免被限制酶降解。 Bertani和和Weigle大肠杆菌噬菌体感染实验大肠杆菌噬菌体感染实验Bertani和和Weigle在探在探索索 和和P2噬噬菌体与宿主菌体与宿主细胞关系时，细胞关系时，均提出了均提出了噬噬菌体感染大菌体感染大肠杆菌后，肠杆菌后，宿主细胞对宿主细胞对入侵的噬菌入侵的噬菌体体DNA表现表
7、现有特异的限有特异的限制作用。制作用。 CEcoli.CEcoli.CEcoli.K12大量繁殖受到抑制Meselson和和Yuan实验实验噬菌体噬菌体 K12和和 C的的DNA分别分别与由与由K12菌菌体制备的细体制备的细胞抽提物保胞抽提物保温，并藉蔗温，并藉蔗糖密度梯度糖密度梯度离心观察两离心观察两种种DNA沉降沉降速度的变化。速度的变化。 K12 DNA C DNA加入加入K12K12菌体制备的细菌体制备的细胞抽提物胞抽提物蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 实验表明，这种限制的本质是宿主细胞实验表明，这种限制的本质是宿主细胞K12中存在有能使外来中存在有能使外来DNA( CDNA)有限有
8、限降解的核酸水解酶。降解的核酸水解酶。 此后，又进一步证实了大肠杆菌此后，又进一步证实了大肠杆菌K12中中的修饰体系即为甲基化酶，该酶修饰了的修饰体系即为甲基化酶，该酶修饰了 K12 DNA上的特异部位，使其不被限制体上的特异部位，使其不被限制体系的酶切割。系的酶切割。结论表明：结论表明：n1965年年阿尔伯阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在着一种首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶。并于具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分年成功分 离出离出I型限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在两种型限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在两种不同功能但又相关
9、的酶。不同功能但又相关的酶。n1970年年史密斯从史密斯从流感噬血杆菌流感噬血杆菌d株中株中分离出了分离出了II型限制性型限制性内切酶；同年内切酶；同年内森斯内森斯使用该酶降解猕猴肿瘤病毒使用该酶降解猕猴肿瘤病毒SV40的的DNA，首次完，首次完 成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从此成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶，推动了基因工此成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶，推动了基因工程的发展。程的发展。n1978年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔奖。奖。阿尔伯阿尔伯(1929) 瑞士微生物遗传瑞士微生物遗传
10、学家学家 H.O.史密斯史密斯(1931) 美国分子生物学家、美国分子生物学家、遗传学家遗传学家 内森斯内森斯(1928) 美美国微生物遗传学家国微生物遗传学家 限制性内切酶限制性内切酶命名规则命名规则 限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母取，即由其属名的第一个字母(大写大写)与种名的第与种名的第一、二两个字母一、二两个字母(小写小写)组成酶的基本命名，若酶组成酶的基本命名，若酶的产生菌有株系之分，则有的产生菌有株系之分，则有4个或个或4个以上拉丁字个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。母组成，其第四个字母之后表示株系。
11、 如如 EcoRI来源于来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于来源于B.amyloliquefaciensH in d IIHaemophilus(属名属名)Influenzae(种名种名)d(株系株系)罗马数字罗马数字限制性内切酶命名举例限制性内切酶命名举例 限制性内切酶分类限制性内切酶分类 已发现的限制酶可以分为三类或称已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：作三型：I、II、III型。他们在酶反应中型。他们在酶反应中所需要的所需要的辅因子辅因子和和切割切割DNA的位点的位点都不都不相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。也有差
12、别。 类别类别反应必须因子反应必须因子专一性专一性 活性活性 I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+识别部位和切点不同，无特定切割位点内切内切甲基化甲基化 II型型Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位只有限制酶只有限制酶活性活性 III型ATP，Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位内切内切甲基化甲基化限制性内切酶分类限制性内切酶分类 II II型限制酶的识别特异性型限制酶的识别特异性 回文识别序列回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构双重对称结构性结构,或称回文序列或称回文序列 (Palindromic Sequence) 非典型
13、回文识别序列非典型回文识别序列 回文识别序列被一至几个其他核苷酸（回文识别序列被一至几个其他核苷酸（N）所间隔，得到的是非典型的双轴对称性序列所间隔，得到的是非典型的双轴对称性序列。 Bgl I GCCNNNN NGGCMst II CC TNAGG 非回文识别序列非回文识别序列 也有些限制酶识别序列非回文结构，切割位也有些限制酶识别序列非回文结构，切割位点在距识别序列点在距识别序列5至至13个个bp处。处。5 GACGCNNNNN 33 CTGCGNNNNNNNNNN 5例：例：Hgn I GACGC 有些限制酶可识别多重序列。如：有些限制酶可识别多重序列。如：Hind II，识别，识别序列
14、为序列为GTPyPuAC，可识别，可识别种序列。种序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）类似的内切酶还有类似的内切酶还有 Acc I 、Ava I 、Ban I 、Hae I 等，它等，它们的特异性低于单一识别序列的酶。们的特异性低于单一识别序列的酶。 识别序列的长度与剪切频率识别序列的长度与剪切频率 大部分大部分II型限制性内切酶的识别序列长度为型限制性内切酶的识别序列长度为4-8个个核苷酸。识别长度决定了剪切核苷酸。识别长度决定了剪切DNA的频率（的频率（1/4n，n为识别的长度）。为识别的长度）。识别长度愈长
15、，则切点少、产生片识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性高。段少而长度长，酶特异性高。限制酶剪切频率片断大小特点Sau3A I (GA TC)1/44250 bp片断数目多,长独短,特异性低Hinf I (GANTC)1/451 kbEcoR I (GAA TTC)1/464 kb片断较少,长度适中NotI (GCGGCCGC)1/4865 kb可提供很长的片断,特异性强限制酶的切割特异性和限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构酶切片段的末端结构 切割位点专一切割位点专一 作为工具酶的作为工具酶的限制性内切酶限制性内切酶有固定的切割位点；有固定的切割位点； 产物具有特定的末端结构
16、产物具有特定的末端结构 当一个当一个DNA分子被限制酶切开后形成两个末端，全部分子被限制酶切开后形成两个末端，全部产物具有相同的末端结构。即一种限制性内切酶切割任何产物具有相同的末端结构。即一种限制性内切酶切割任何DNA只产生一种固定形式的末端结构，只产生一种固定形式的末端结构，在在DNA连接酶的作连接酶的作用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的DNA分子；分子；而不同限制酶则形成不同末端结构。而不同限制酶则形成不同末端结构。5 - G3 - CTTAA +AATTC - 3 G - 55 - GAATTC - 33 - CTTAAG - 5 5 -
17、GAATTC - 33 - CTTAAG - 5 任何一种任何一种限制酶切割限制酶切割DNA链时，总是水解核苷酸链时，总是水解核苷酸 3、5-磷酸双酯键的磷酸双酯键的3位磷酸酯键，使产物的位磷酸酯键，使产物的5端带磷端带磷 酸单酯基团，而酸单酯基团，而3为游离羟基。为游离羟基。 由于切割位点不同，由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构所有的限制酶可产生两类末端结构 平末端平末端（Blunt End）指酶切片段为齐头末端结构）指酶切片段为齐头末端结构 。 粘性末端粘性末端（Cohesive End）酶切后）酶切后DNA片段末端带有片段末端带有 1-4个核苷酸残基长度的单链结构个核苷酸残
18、基长度的单链结构 ，而片段，而片段 两端突出的单链具有互补的序列。两端突出的单链具有互补的序列。 粘性末端又可分为粘性末端又可分为 5-粘性末端粘性末端与与 3-粘性末端。粘性末端。 5 NOH 3 5PO4N 3粘性末端粘性末端3-粘性末端粘性末端5-粘性末端粘性末端平末端平末端 5 - GAATTC - 3 3 - CTTAAG - 5 EcoR I 5 -G AATTC - 33 -CTTAA G - 5 5 - CTGCAG - 3 3 - GACGTC - 5 Pst I5 - CTGCA G - 33 - G ACGTC - 5 5 - CCCGGG - 3 3 - GGGCCC
19、- 5 Sma I5 - CCC GGG - 33 - GGG CCC - 5有没有例外？有没有例外？A） 含多重识别序列的限制酶含多重识别序列的限制酶 如如 Hind II Hind II 在顺序在顺序GTPyPuAC 剪切，可产生剪切，可产生3种不同种不同 类型片段，互相连接的可能性为类型片段，互相连接的可能性为 1/3。B） 含非典型识别序列的限制酶含非典型识别序列的限制酶 如如 EcoN I 在顺序在顺序CCTNNNNNAGC 剪切，剪切，N可以是任何核可以是任何核 苷酸，由于苷酸，由于N的随意性，往往会产生不广泛匹配的片段。的随意性，往往会产生不广泛匹配的片段。C） 在次理想条件下，
20、限制酶表现出在次理想条件下，限制酶表现出星状活性星状活性，影响正常匹配。，影响正常匹配。 有时有时 例：例： BamH I G GATCCBcl I T GATCABgl II A GATCT 这类能产生相同粘性末端而识别特异性不同的限制酶称作这类能产生相同粘性末端而识别特异性不同的限制酶称作同尾限制酶同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶产生的）。同尾限制酶产生的DNA片段可片段可借借DNA连接酶互相重组，但新产生的杂合序列将不再被原有的连接酶互相重组，但新产生的杂合序列将不再被原有的限制酶所识别。限制酶所识别。 5 - G GATCT - 3 DNA 5 - GGATCT -
21、3 3 - CCTAG A - 5 连接酶连接酶 3 - CCTAGA - 5 (BamH I 片段片段) (Bgl II 片段片段) (产生杂合识别序列产生杂合识别序列) 按手册或商品说明书按手册或商品说明书 反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。 常用的缓冲液选择常用的缓冲液选择 Tris-Hcl 。同时还。同时还 要加入要加入 Mgcl2 和和 2-巯基乙醇巯基乙醇。 反应温度：反应温度： 一般限制性内切酶的反应温度是一般限制性内切酶的反应温度是 37c。 酶活性单位：酶活性单位： 1个酶活性单位是指一种酶在其最适宜的个酶活性单位是指
22、一种酶在其最适宜的 反应条件下，反应条件下，1小时使小时使 1g 噬菌体噬菌体DNA 底物完全水解的酶量。但由于许多因素可底物完全水解的酶量。但由于许多因素可 影响内切酶的水解反应和用量，实际用量影响内切酶的水解反应和用量，实际用量 需比所需用量需比所需用量多加一倍多加一倍左右。左右。 第二活性第二活性 在次理想条件下在次理想条件下,一些限制性内切酶的特异型会被降一些限制性内切酶的特异型会被降低低,只有部分正常识别位置被识别只有部分正常识别位置被识别,此称为此称为第二活性第二活性（Secondary Activity），也称星号活性（），也称星号活性（Star Activity），），加以加以
23、“ *”表示，如表示，如 EcoR I*。酶的第二活性将引起底物。酶的第二活性将引起底物DNA链上切口增多，酶解片断变小，造成特异性降低。链上切口增多，酶解片断变小，造成特异性降低。例：理想条件下例：理想条件下 （PH=7.5） EcoR I G AATTC 次理想条件下次理想条件下 （PH=8.5） EcoR I * AATT次理想条件次理想条件：通常包括不适合的离子强度、过高的：通常包括不适合的离子强度、过高的PH、 二价金属离子的替换、较高的甘油浓度等。二价金属离子的替换、较高的甘油浓度等。 限制酶的保质期限制酶的保质期 一般是在检定日以后的一年内，但几乎一般是在检定日以后的一年内，但几
24、乎所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失活活, 因此购入后即使是经过长时间保存的酶因此购入后即使是经过长时间保存的酶, 也完全可以使用，但这些酶在使用前最好再也完全可以使用，但这些酶在使用前最好再测一次活性。另外，保存酶时即便让其冻结测一次活性。另外，保存酶时即便让其冻结，大部分酶也不会急剧失活。，大部分酶也不会急剧失活。 EcoRIPstISmaI 研究酶的理化性质及其作用原理，对于阐明生研究酶的理化性质及其作用原理，对于阐明生命现象的本质和规律具有十分重要的意义（包括命现象的本质和规律具有十分重要的意义（包括酶的结构功能、酶与代谢调节、酶与生物的生长、
25、酶的结构功能、酶与代谢调节、酶与生物的生长、发育、进化、疾病等）发育、进化、疾病等） 。 从酶分子水平去探讨酶与生命活动、与代谢调从酶分子水平去探讨酶与生命活动、与代谢调节、与疾病、生长发育等等的关系，对阐明某些节、与疾病、生长发育等等的关系，对阐明某些生命活动的本质和规律，无疑也具有十分重要的生命活动的本质和规律，无疑也具有十分重要的意义。意义。 二、酶是生命科学研究的重要对象二、酶是生命科学研究的重要对象 同功酶同功酶n同工酶同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，是指催化的化学反应相同，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质而酶蛋白的分子结构、理化性
26、质乃至免疫学性质不同的一组酶不同的一组酶, ,存在于生物的同一种属或同一个存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。n目前已发现有目前已发现有150150多种酶具有同工酶多种酶具有同工酶，如，如6-6-磷酸磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖谷丙转氨酶和谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、过氧化酶和胆碱酯酶等。其中，发现最核酸酶、过氧化酶和胆碱酯酶等。其中，发现最早，早，研究最多的是乳酸脱氢酶（研究最多的是乳酸脱氢酶（LDHLDH）同工酶
27、）同工酶. .例：例：LDHLDH同工酶的两种亚基以不同比例组成五种四聚体：同工酶的两种亚基以不同比例组成五种四聚体：LDH1(H4)LDH1(H4)、LDH2(H3M)LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)LDH4(HM3)和和LDH5(M4)LDH5(M4)。 Dogfish LDH M4结构图 同功酶与物种进化同功酶与物种进化 同工酶是生物进化过程中为适应愈趋复同工酶是生物进化过程中为适应愈趋复杂的代谢而引起的一种分子进化，以适应不杂的代谢而引起的一种分子进化，以适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要. .
28、 同功酶在各器官和组织中的分布不同。同功酶在各器官和组织中的分布不同。这样就可以这样就可以根据同工酶酶谱差异并配合其它根据同工酶酶谱差异并配合其它方法从分子水平探讨物种进化、遗传变异等方法从分子水平探讨物种进化、遗传变异等一些生命现象。一些生命现象。 在正常情况下血清中同功酶谱是相对稳定在正常情况下血清中同功酶谱是相对稳定的。当某一组织或器官发生病变时，就有某的。当某一组织或器官发生病变时，就有某种特殊的同工酶释放出来，引起血清中同功种特殊的同工酶释放出来，引起血清中同功酶活性的改变。对病人及正常人同工酶电泳酶活性的改变。对病人及正常人同工酶电泳图谱进行比较，有助于上述器官疾病的诊断。图谱进行
29、比较，有助于上述器官疾病的诊断。 在临床上已应用同工酶做诊断指标在临床上已应用同工酶做诊断指标, ,例如例如: : 冠心病及冠状动脉血栓冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损者血引起的心肌受损者血清中清中LDH(H4)LDH(H4)及及LDH2(MH3)LDH2(MH3)含量增高含量增高; ; 而肝细胞受损而肝细胞受损患者血清中患者血清中LDH5(M4)LDH5(M4)增高。增高。 同功酶与其它同功酶与其它 同工酶的研究不仅在临床血液病、同工酶的研究不仅在临床血液病、肿瘤及其它疾病的诊断方面占有重要肿瘤及其它疾病的诊断方面占有重要地位，而且在地位，而且在分子遗传学、物种鉴定、分子遗传学、物种鉴定、
30、法庭取证、亲子鉴定、优生优育法庭取证、亲子鉴定、优生优育等领等领域中也具有广阔的应用前景。域中也具有广阔的应用前景。 肿瘤的酶异常肿瘤的酶异常 肿瘤酶异常原因：肿瘤酶异常原因：1 1、肿瘤过多或过少产生酶、肿瘤过多或过少产生酶2 2、肿瘤阻塞了酶通过的导管系统、肿瘤阻塞了酶通过的导管系统3 3、肿瘤诱导酶产生、肿瘤诱导酶产生4 4、细胞通透性改变使可溶性酶进入血液循环、细胞通透性改变使可溶性酶进入血液循环 临床诊断还没有单一指标可确诊癌，临床诊断还没有单一指标可确诊癌， 所以酶测定可作为一种辅助手段，如：所以酶测定可作为一种辅助手段，如：n测定血清淀粉酶测定血清淀粉酶胰腺癌胰腺癌n酸性磷酸酶酸
31、性磷酸酶前列腺癌前列腺癌n亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脱氢酶等同亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脱氢酶等同工酶谱变化工酶谱变化肝癌、结肠癌、直肠癌。肝癌、结肠癌、直肠癌。端粒酶端粒酶 l端粒、端粒酶与肿瘤发生的关系是近年端粒、端粒酶与肿瘤发生的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一。有研究表来肿瘤研究领域的热点之一。有研究表明明,端粒酶在端粒酶在85%95%的恶性肿瘤的恶性肿瘤组织中有阳性表达组织中有阳性表达,而在正常体细胞则而在正常体细胞则一般为阴性。因此端粒酶抑制剂的研究一般为阴性。因此端粒酶抑制剂的研究为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计及基为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计及基因治疗开辟了一个新的途径。
32、因治疗开辟了一个新的途径。 端粒端粒(telomere)(telomere) l真核细胞染色体末端以真核细胞染色体末端以 TTAGGGTTAGGG 6 6个碱基序列重个碱基序列重复组成的复组成的DNADNA结构结构l人体细胞染色体端粒长度约为人体细胞染色体端粒长度约为5 515Kb,15Kb,其功能其功能在于在于保护染色体免受核酶降解保护染色体免受核酶降解, ,防止断端融合重防止断端融合重排或降解。如果端粒长度缩短到极限如排或降解。如果端粒长度缩短到极限如4Kb4Kb以下以下时时, ,细胞则会丧失分裂增殖能力而发生凋亡细胞则会丧失分裂增殖能力而发生凋亡, ,该该过程称为监控点激活过程称为监控点
33、激活(checkpoint activation)(checkpoint activation)。l端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子信号信号, ,端粒被称为细胞寿命的端粒被称为细胞寿命的“分裂钟分裂钟”。端粒的保护机制端粒的保护机制 在真核细胞在真核细胞,端粒端粒DNA的富的富G链较富链较富C链超出链超出约约1216bp,形成形成3端的突出单链结构端的突出单链结构,而而端粒蛋白质能够特异地识别这一突出区域并端粒蛋白质能够特异地识别这一突出区域并与之结合与之结合,再通过进一步的折叠、盘曲再通过进一步的折叠、盘曲,从而从而形成染色体末端具有保护功能的
34、形成染色体末端具有保护功能的“帽子帽子”,在防止染色体互相融合、重组等方面都发挥在防止染色体互相融合、重组等方面都发挥着十分重要的作用着十分重要的作用 端粒酶端粒酶(telomerase)(telomerase) l依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶, ,其实质是一种核糖核蛋白酶其实质是一种核糖核蛋白酶( (ribonucleoribonucleo protein,RNP), protein,RNP),能识别特定的端粒重能识别特定的端粒重复序列复序列, ,以自身以自身RNARNA的部分序列的部分序列(5-CUAACCCUAAC- (5-CUAACCCUAAC- 3)3)为模板为模
35、板, ,合成新的端粒重复序列合成新的端粒重复序列, ,使端粒延长。使端粒延长。l是已知的恶性肿瘤特异性最强的生物标志物。是已知的恶性肿瘤特异性最强的生物标志物。 l也表达于生殖细胞、造血干细胞等非肿瘤细胞中。也表达于生殖细胞、造血干细胞等非肿瘤细胞中。 医疗新途径医疗新途径 美国美国Geron公司的研究者已经表明成熟的公司的研究者已经表明成熟的癌细胞具有端粒酶癌细胞具有端粒酶,使得它们逃脱了衰老法则。使得它们逃脱了衰老法则。美国美国Geron公司希望能够通过抑制端粒酶的活公司希望能够通过抑制端粒酶的活性来对癌细胞发起攻击性来对癌细胞发起攻击,或者是制造一种病毒或者是制造一种病毒,该病毒能够杀死表达端粒酶的癌细胞该病毒能够杀死表达端粒酶的癌细胞,但是对但是对于正常的细胞却没有影响。于正常的细胞却没有影响。