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1、血库实验室技术一、实验操作的一般原则（一）.使用商品化试剂前，必须认真阅读试剂使用说明书；（二）.所有的实验过程必须严格遵循实验室所制定的标准操作规程进行，任何人员不得随意更改步骤；（三）.实验所用的试管及玻片都应清洁（最好不要重复使用），并且做好明确清楚的标记；（四）.在实验过程中应先加血清，并检查确认每个试管，再加入细胞；一、实验操作的一般原则（五）.判读结果时，应该先判读对照管，只有在对照管结果符合预期结果时，才可进一步判读试验结果；（六）.判读结果时，要对实验结果进行逐一判断，不要多个试管同时进行；（七）.要完整记录所有的试验现象，如抗体鉴定中的溶血；（八）.及时记录实验结果，不要凭记
2、忆补做记录；一、实验操作的一般原则（九）.在记录实验结果时注意阴、阳性的书写，以避免书写不清楚发生混淆，而导致的最终结果的错报；建议对阳性结果用繁体字“陽”字记录；阴性结果应记录“阴”或“O”；（十）.在正确完整的记录了所有的结果后，才能对实验结果进行分析说明；（十一）.在实验记录单上应标明：试剂的厂家、批号、实验日期、室内质控结果、实验操作者及复核者；一、实验操作的一般原则（十二）.实验全过程中应避免样本间的交叉污染；（十三）.操作过程中，严格按照实验室生物安全的相关要求做好个人防护；（十四）.不合格标本不能接受做血型定型和交叉配血试验。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基
3、础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础-凝集反应1.凝集反应定义 2.凝集反应的两个阶段3.凝集反应的特点1.凝集反应定义 细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗颗粒性抗原粒性抗原，或，或可溶性抗原可溶性抗原（或抗体）与（或抗体）与载体载体颗颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗粒结合成
4、致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生原）发生特异性反应特异性反应，在适当，在适当电解质电解质存在下，存在下，形成形成肉眼肉眼可见的凝集现象可见的凝集现象。抗原抗原抗原抗原排斥排斥抗原抗原抗体抗体凝集反应凝集反应抗原抗原抗原抗原抗原抗原2.凝集反应的两个阶段第一阶段：抗原抗体的特异性结合；第一阶段：抗原抗体的特异性结合；第二阶段：出现肉眼可见的凝集现象。第二阶段：出现肉眼可见的凝集现象。3.凝集反应的特点Z电位：颗粒性抗原表面双层离子云所形成的电位差。抗原抗体特异性互补结合时，抗体桥联作用克服Z电位而使颗粒聚集在一起。IgM类抗体：完全抗体，分子量大，抗体桥联作用足以克服Z电位，使颗粒聚集在
5、一起；IgG类抗体：不完全抗体，分子量小，抗体桥联作用不足以克服Z电位，颗粒不能聚集；3.凝集反应的特点在实验时，为促使凝集现象的出现，可采取以下措施：a.加电解质或蛋白质，降低离子强度缩短颗粒间的距离；b.加入右旋糖苷或葡聚糖，增加试验溶液的粘滞度；c.用胰酶或神经氨酸酶处理，改变表面结构；d.以离心方法克服颗粒间的排斥力等。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免
6、疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查二、常用的红细胞血清学技术（二）标本（二）标本：1.血样的采集血样的采集2.红细胞悬液的配制红细胞悬液的配制3.标本的保存标本的保存1.血样的采集.红细胞标本：作为抗原的红细胞标本，可用末梢血，直接用生理盐水配制成悬液；在多数情况下是静脉采血，用ACD或CPD血液保存液抗凝，或乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）抗凝，血液与保存液之比为4:1，每毫升血用5%的Na2-EDTA 0.1ml。用于抗球蛋白试验的红细胞标本要抗凝，原因为：不抗凝标本在温度较低的情况下，自身冷抗体会与红细胞作用，活化补体，使红细胞上结合有C3b和C4b，造成抗球蛋白试验的假阳性
7、。1.血样的采集 .血清标本：取静脉血慢慢注入干燥管内，置37恒温箱，待凝固后用玻璃棒搅动血块，使之与管壁剥离，然后置4 过夜、离心分离血清。必要时血液凝固后即离心分离血清，但分出的血清较少，同时也没有4 过夜吸收冷自身抗体的作用。需要补体参与的血清学试验，要用新鲜血清，或添加新鲜AB型血清作为补体来源；而有些试验用的血清或做试剂用的血清则要经56 30min灭活补体后使用。一般试验避免使用血浆，防止纤维蛋白原的干扰。2.红细胞悬液的配制.用于血型鉴定、交叉配血的红细胞至少要用大量的生理盐水洗一遍，通过洗涤可以去除吸附在红细胞表面的血型物质、血浆蛋白质、抗凝剂等成分。.配制悬液时应将最后一次洗
8、涤的红细胞 3000转/分 离心30分钟压积，在不去除上层盐水的情况下，吸取一定量的压积细胞按体积百分比配制成所需要浓度的悬液。一般洗涤压积的红细胞1滴，加8滴生理盐水，配制成的浓度为10%的细胞悬液。10%的悬液：测定抗体亲和力；2%的悬液：滴定抗体效价；5%的悬液：常用于血型鉴定或间抗试验。3.标本的保存血清标本：不稀释的血清标本如加防腐剂（10%的叠氮钠防腐，最终浓度为0.1%）可在4保存数月，但要防止干涸；如在-20 可保存数年，抗体活性基本不变。红细胞标本:一般试验用的凝血标本要在5天之内使用，以不溶血为准。如用ACD或CPD血液保存液可保存3周，各种保存的红细胞在使用之前都要用生理
9、盐水洗涤一遍。在操作的每一环节中所用的盐水尽可能使用注射用生理盐水，在高温环境里的使用间歇，盐水也应置4 贮存，防止长菌。生理盐水稀释的血清只限当天使用。用作交叉配血的供、受者标本要在4保存一周，以便在出现输血反应时可备查用。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查二、常用的红细胞血清学技术（三）盐水介质凝集试验1.概述2.方
10、法3.离心的要求4.试验记录5.缗钱状凝集的处理 1.盐水介质凝集试验概述 盐水介质凝集试验中的抗原是用盐水作为介质的红细胞悬液，红细胞上的抗原决定簇与相应的抗体分子特异性结合，红细胞交叉联接形成肉眼可见的凝集反应。盐水介质凝集试验用于IgM抗体的检出与鉴定、盐水配血试验，以及某些血型系统的血型鉴定，如ABO、MN、P等。在盐水介质中，凝集是IgM抗体的行为，但在ABO血型系统中，A、B抗原位点多，当IgG抗A、抗B的浓度足够大时，在盐水介质中也能发生凝集。2.盐水介质凝集试验的方法 平板法：有玻璃片、陶瓷板、搪瓷板、塑料板、以及防剩漏的血型纸等多种质地的平板可供选用，现在多用的带凹的专用板，
11、操作方便。操作时在平板上做好标记，加一滴待检血清或试剂血清，再加红细胞盐水悬液1滴，混匀后放置于室温，并不时转动反应板，以加速反应的发生。反应快的在混匀后数秒即出现凝集，最迟在15分钟内肉眼观察结果，亦可用低倍镜观察。2.盐水介质凝集试验的方法 试管法：为推荐方法。根据需要取小试管一支或数支，做好标记，每管加血清2滴，再加所需浓度的相应红细胞悬液1滴，然后根据抗体的性质置于37，或18-22，或4作用一小时，观察结果。常用的台式小离心机以1000转/分 离心 1min观察后结果。2.盐水介质凝集试验的方法 在盐水凝集试验，一般设两个对照：一个是有相应抗原的红细胞与抗体反应作为阳性对照；另一个是
12、不带抗原的红细胞与血清反应作为阴性对照。只有对照管的结果正确，试验结果才可靠。3.盐水介质凝集试验中离心的要求 在盐水法测定血型和交叉配血时，多采用立即离心法。正确操作应该是将红细胞悬液加到血清后立刻离心。对于ABO血型系统，如果在室温放置2分钟后离心，可能使3+-4+的凝集减弱为0（-）-1+，并有明显或不明显的溶血。如果在室温放置5分钟后离心，原来有的凝集可能消失，并有溶血。还有些标本在延迟离心后，本应有的凝集会变为既不凝集又不溶血，因而发现不了ABO血型的不配合，这种情况多发生在O型血清与其他型的红细胞试验中，发生率在2%-3%左右。4.盐水介质凝集试验实验记录判读结果前应预先设计好记录
13、册，在记录册上标记好细胞样本和血清样本的位置，一边观察，一边记录结果。常用的记录符号及所示的凝集强度如下：4+：一个大凝块，背景透明，无游离细胞；3+：数个大凝集块，背景透明，无游离细胞；2+：许多小凝集块，肉眼可见，大小均匀，背景基本透明，有游离细胞。1+：很小的凝集块，肉眼还可见，背景不透明，游离细胞较多，常要用显微镜观察。0（-）：无凝集，无溶血，全是游离细胞，要用显微镜观察。pH:部分溶血。H：完全溶血。5.盐水介质凝集试验中缗钱状凝集的处理缗钱状凝集，也称钱串状凝集，是一种红细胞的假性凝集，一般红细胞在自身血浆中沉降时可以看到缗钱状的形成。在血浆球蛋白异常时，如高球蛋白血症、巨球蛋白
14、血症时会出现缗钱状；另外在患者使用大分子右旋糖酐和羟乙基淀粉溶液作为血容量扩张剂时也可产生缗钱状凝集。实验中遇到缗钱状凝集时，可将血清进行适当稀释后进行试验；在显微镜下观察到缗钱状凝集时加一滴生理盐水通常就可以消除。缗钱状凝集一般不影响间抗试验，严重的可在37孵育前加1-2滴生理盐水，孵育过程中摇动数次。二、常用的红细胞血清学技术（四）胶体介质凝集试验1.原理2.常用的胶体介质3.方法二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十
15、）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查1.胶体介质凝集试验原理 IgG抗体在盐水介质里通常不发生凝集，但如果用胶体介质配制红细胞悬液，胶体介质缩短了红细胞间的距离，当红细胞上的抗原与遇到血清中与它相对应的IgG抗体，二者发生特异性结合，并出现肉眼能观察到的凝集现象。2.胶体介质凝集试验常用的介质 用以构成胶体介质的物质有：牛血清白蛋白，人白蛋白，AB型血清，受检者本人血清，阿拉伯树胶等。其中以AB型血清取材方便，牛白蛋白效果好，使用较多。人AB型血清：无额外抗体、含A，B血型物质少、促进凝集强的可备用。牛白蛋白：商品化、常用22%的
16、浓度（促凝效果最好）、30%的浓度（有利于检出部分弱的Rh抗体）、7%的浓度（有利于IgG 抗-A和抗-B的检出）。3.胶体介质凝集试验的方法 胶体介质配血法：在两支小试管中分别加供者和受者的5%盐水红细胞悬液1滴，然后加适量的生理盐水，混匀，离心去上清，沥干。再分别加受者和供者的血清两滴，混匀，立即离心，轻轻摇动观察结果，如有凝集或溶血，表示不配合，不必进行下面的试验，如没有凝集或溶血，再各加两滴AB型血清或牛白蛋白溶液，37孵育一小时，读取结果。也可孵育15-30分钟转入抗球蛋白试验。白蛋白铺层法：是一种比较简单实用的方法。操作时在做好标记的试管内加2-3滴血清，在加5%盐水红细胞悬液1滴
17、，混匀，置37孵育15-30分钟。3400转/分 离心15秒，不要摇动红细胞扣。然后沿管壁加2滴牛白蛋白溶液，使其在红细胞扣上形成一薄层，不要混合，置37孵育5-10分钟，轻轻摇动，读取结果。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查二、常用的红细胞血清学技术（五）酶处理细胞的凝集试验1.原理2.常用的酶3.方法4.关于酶处理红
18、细胞凝集素1.酶处理细胞的凝集试验原理 红细胞表面有丰富的唾液酸，在中性环境里红细胞带负电荷，所以红细胞之间是相互排斥的。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸，减少红细胞表面的负电荷，从而使红细胞距离缩短，IgG内抗体分子就能与有相应抗原的红细胞产生凝集。酶法能显著增强Rh和Kidd系统的抗原抗体反应，但同时会破坏M、N、S、s、Fya和 Fyb抗原，对它们不能用酶处理的方法。2.酶处理细胞的凝集试验常用的酶.常用的酶有菠萝酶、木瓜酶、胰酶、无花果酶等。.酶的配制和保存：配制略。保存-20可以保存2个月。用前融化，当日用不完必须弃去。在配制酶溶液时要注意个人防护。另外，各种酶粉都容易潮解，要注意密封
19、保存。3.酶处理细胞的凝集试验的方法.一期法酶试验。.二期法酶试验。4.酶处理细胞凝集素 酶处理细胞凝集素：是指有一些抗体能与胰酶、木瓜酶、菠萝酶等酶处理的细胞发生凝集，但不与未处理的细胞反应，原因可能是酶处理后某些抗原位点得以暴露，且不同酶暴露的位点不完全相同，把这类能与酶处理后的红细胞发生凝集的抗体可称为酶处理细胞凝集素。通常不引起输血反应。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二
20、）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查二、常用的红细胞血清学技术（六）抗球蛋白试验1.原理2.抗球蛋白试剂3.方法4.试剂对照细胞的制备5.增强抗球蛋白试验的方法6.结果分析7.临床应用1.抗球蛋白试验原理 抗球蛋白试验又称Coombs试验，原理为：红细胞表面包被了IgG抗体分子，或补体分子C3、C4的片段，但不能出现凝集现象。IgG抗体和补体都是人球蛋白，用它们免疫动物，或者通过杂交瘤技术可以得到抗球蛋白，这类抗球蛋白的特异性针对IgG分子的FC段或补体C3、C4的片段，可以和包被在红细胞上的IgG抗体和补体作用，从而起到搭桥的作用，使红细胞发生凝集。抗球蛋白试验又称C
21、oombs试验抗球蛋白试验2.抗球蛋白试剂多特异性抗球蛋白试剂：曾称为广谱抗球蛋白试剂，试剂中应含有抗-IgG和抗-C3d。一般用杂交瘤技术制备的单克隆抗体比较纯一。它主要用于配血试验和直接抗球蛋白试验，尤其适用于自身免疫性溶血性贫血的直接抗球蛋白试验。单特异性抗球蛋白试剂：主要为抗-IgG和抗-C3d两种。其中抗-IgG用于配血试验，及抗体的检出和鉴定；对温抗体型的自身免疫性溶血性贫血的患者，一般先用多特异性抗球蛋白试剂做直接抗球蛋白试验，如出现阳性，再用抗-IgG和抗-C3d来分型。另外，冷凝集素病是由IgM引起的，但包被的在红细胞上的IgM在洗涤过程中容易解离，留在红细胞上的主要为补体片
22、段，所以冷抗体引起的自身免疫性溶血性贫血一般是补体型的。3.抗球蛋白试验方法直接抗球蛋白试验间接抗球蛋白试验（1 1）直接）直接CoombsCoombs试验试验不完全抗体不完全抗体检测红细胞上抗体检测红细胞上抗体（2 2）间接间接CoombsCoombs试验试验检测血清中的检测血清中的抗红细胞抗体抗红细胞抗体4.抗球蛋白试验试剂对照细胞的制备 在直抗和间抗试验中，阴性结果都要用试剂对照细胞检查，也就是要用IgG和补体致敏的红细胞去验证实验结果的可靠性。4.抗球蛋白试验试剂对照细胞的制备 IgG致敏的红细胞的制备 37、15-30minO型Rh（+）cell+IgG抗-D 配成5%的悬液备用 3
23、次以上盐水洗涤 4.抗球蛋白试验试剂对照细胞的制备 补体致敏的红细胞的制备 置20ml10%的蔗糖溶液于一只大试管中，加4-6滴新鲜血液，或加2滴洗涤过的压积红细胞和4滴AB型新鲜血清，孵育 37、15-30min；用生理盐水洗涤3次以上配制成3%的细胞悬液备用。（4 可保存48小时）5.增强抗球蛋白试验的方法酶法：对某些Rh、Lewis、Kidd系统抗体的反应有明显增强作用。低离子介质法：红细胞用低离子强度的溶液配制成的悬液做间抗试验，可缩短致敏时间15min。牛白蛋白法：在间抗试验的试管中加2滴30%的牛白蛋白溶液，可缩短致敏时间15min。聚乙二醇法：在间抗试验的试管中加4滴10%分子量
24、为4000的聚乙二醇(PEG)溶液，可缩短致敏时间15min。6.抗球蛋白试验的结果分析阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管凝集者为阳性，不凝集者应再进一步加入试剂对照细胞，如果凝集为则实验结果为阴性。如阳性或阴性对照出现不规则结果应分析原因，重新试验。6.抗球蛋白试验的结果分析注意事项：离心过度，红细胞不易散开，可导致假阳性。红细胞在盐水洗涤时已有凝集，可导致假阳性。红细胞洗涤时应迅速、连续，不应中途停止。标本采集后立即进行试验，延迟试验或中途停止试验，可使抗体从细胞上丢失（直抗）。抗球蛋白血清严格按照操作说明书使用，否则可产生前带或后带反应，导致假阴性。6.抗球蛋白试验的结果分析注意事
25、项：红细胞上吸附抗体太少，或Coombs阴性自身免疫性溶血性贫血直抗试验可呈假阴性反应。全凝集或冷凝集血标本及脐带血标本含有Wharton胶、洗涤不充分，血标本中有很多网织红细胞，以及抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞凝集，出现假阳性。阴性结果应核实：在试管中再加一滴IgG致敏红细胞，如阳性则表示试管内的抗球蛋白血清确未被消耗。7.抗球蛋白实验的临床应用新生儿溶血病（HDN）：胎儿红细胞已被母亲血型抗体致敏时。自身免疫性溶血性贫血（AIHI）：自身抗体吸附自身红细胞时。溶血性输血反应：输入红细胞被受者不完全抗体致敏时。药物性贫血：甲基多巴类药物、青霉素等产生的不完全抗体吸附于红细胞时
26、。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查(七).微柱凝胶试验原理:凝胶具有分子筛效应和亲和效应，在微柱凝胶介质中红细胞抗原与相应的抗体结合，利用凝胶的空间位阻经低速离心，凝集的红细胞悬浮在凝胶的上层，而未和抗体结合的红细胞则沉于凝胶的底部（管底尖部）。微柱凝胶试验原理 将红细胞和抗血清加在凝胶上部反应，离心后观察凝集的将红细
27、胞和抗血清加在凝胶上部反应，离心后观察凝集的将红细胞和抗血清加在凝胶上部反应，离心后观察凝集的将红细胞和抗血清加在凝胶上部反应，离心后观察凝集的红细胞，被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央，证明发生凝集反红细胞，被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央，证明发生凝集反红细胞，被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央，证明发生凝集反红细胞，被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央，证明发生凝集反应，判断凝集反应阳性应，判断凝集反应阳性应，判断凝集反应阳性应，判断凝集反应阳性,游离的红细胞，被挤过装有过滤介质的游离的红细胞，被挤过装有过滤介质的游离的红细胞，被挤过装有过滤介质的游离的红细胞，被挤过装有过滤介质的小柱，而到达小柱的底部
28、，证明未发生凝集判断阴性小柱，而到达小柱的底部，证明未发生凝集判断阴性小柱，而到达小柱的底部，证明未发生凝集判断阴性小柱，而到达小柱的底部，证明未发生凝集判断阴性.二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查（八）.聚凝胺的运用原理：Poly是一种带高价阳离子的多聚物，溶解后能产生很多正电荷，可中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间
29、距离减少，能引起正常红细胞可逆性的非特异性凝聚。而当血清中含有IgG抗体与红细胞上相应得抗原结合在聚凝胺的作用下发生凝集，凝聚和凝集在表面上是不能区分的，再加枸橼酸钠重悬液，枸橼酸根的负电荷与聚凝胺正电荷中和，重悬后凝聚现象消失，而真正的凝集是不会消失的。1 红细胞间有一定间距2 加入聚凝胺后，可以缩短红细胞之间的距离，使其非特异性凝集3 加入枸橼酸钠，可以中和聚凝胺4 红细胞的非特异性凝集消失聚凝胺原理示意图聚凝胺原理示意图1聚凝胺枸橼酸钠1 红细胞上已有不完全抗体致敏2 加入聚凝胺后，缩短红细胞之间的距离，让不完全抗体可以同时与两个红细胞结合使其特异性凝集3 加入枸橼酸钠中和聚凝胺4 由于
30、不完全抗体的结合，红细胞的特异性凝集不消失聚凝胺原理示意图2聚凝胺枸橼酸钠枸橼酸钠不完全抗体不完全抗体二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查（九）.抗体效价滴定1.原理2.方法3.IgM与IgG抗体的区分1.抗体效价滴定原理 将血清经连续倍比稀释后与选定的红细胞进行反应，通常以肉眼观察到的最后一个“+”的凝集管作为判断的终点
31、，终点血清稀释度的倒数为效价或滴度。2.抗体效价滴定方法 取小试管若干，依次编号。每管加盐水0.1（或0.2）ml准确吸取等量血清加入第1管，充分混匀，即为1:2血清稀释液。然后从第1管吸取0.1（或0.2）ml，加入第2管，充分混匀后再吸取0.1（或0.2）ml加入第3管，依次稀释到第n管，稀释度为1:2n。3.IgM与IgG抗体的区分 在有些血清里同一特异性的抗体有IgM也有IgG，如抗-A、抗-B、抗-M、抗-E等。区分IgM和IgG并测IgG的效价，有一定实用意义，特别是对新生儿溶血病的免疫学检测是必不可少的。在盐水介质中凝集是IgM抗体的性质，要检出IgG抗体必须将IgM抗体破坏，常
32、用的方法是巯基试剂处理法。常用试剂为：2-巯基乙醇（2-ME）应用液。巯基试剂区分巯基试剂区分IgMIgM与与IgGIgG的原理的原理待检待检血清血清2-ME(巯基巯基乙醇乙醇)IgM抗体抗体分子裂解分子裂解IgG抗体分抗体分子不被灭活子不被灭活保持血清学保持血清学特性特性(致敏相致敏相应红细胞应红细胞)IgA抗体抗体分子部分分子部分灭活灭活失去与相应失去与相应红细胞凝集红细胞凝集的作用的作用二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价
33、滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查（十）.吸收、放散试验1.吸收试验:抗原与抗体的结合是特异性的，因此具有抗体活性的血清加入相应抗原后，抗体的活性下降或消失，这种作用称为吸收试验。2.放散试验是抗原与抗体的结合是可逆的，在物理条件改变时，抗体又会从抗原抗体复合物上分离下来，将抗体由抗原抗体复合物上分离下来的试验称为放散试验。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体
34、效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查（十一）.凝集抑制试验 概述：抗体能与有相应抗原的红细胞发生特异性凝集，体液中的可溶性抗原物质能与该抗体发生特异的中和，抑制了抗体凝集红细胞的作用。用这种可溶性物质来抑制抗体与红细胞凝集的试验，称为凝集抑制试验。常用于ABH或Lewis分泌状态的检查，帮助ABO亚型的确认以及特殊情况下（红细胞标本完全溶血）ABO血型的鉴定。二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微
35、柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查（十二）.新生儿溶血病的免疫学检查1.发病机理2.标本的要求3.母婴标本的ABO血型检测4.新生儿标本的检查5.母亲标本的检查1.新生儿溶血病发病机理 新生儿溶血病起源于胎儿从父亲方面继承了一些母亲没有的红细胞抗原，使得母婴血型不合，母体存在与胎儿RBC血型抗原相应的免疫性抗体（IgG类），此免疫性抗体可以通过胎盘进入胎儿体内，并包被在胎儿RBC上，在分娩前后加速胎儿RBC破坏发生溶血，造成胎儿发生以溶血为主要损害的一种被动免疫性疾病。1.新生儿
36、溶血病发病机理 无论是哪种血型系统不合，必须具备以下两条才能引起新生儿溶血病（HDN）：1.母亲血浆中必须有与胎儿不相合的抗体；2.此种抗体能通过胎盘进入胎儿体内。1.新生儿溶血病发病机理 国内常见的血型不合引起的新生儿溶血为ABO及Rh血型不合，其中以ABO不合者居多，Rh不合者次之。ABO-HDN一般母亲均为O型，婴儿为A或B型（以A型较多），多发生在第一胎。Rh-HDN一般母亲多为Rh-、子代为Rh+，多发生于第二胎，发病较重。如孕妇曾有输血史或流产史，也可发生在第一胎。2.标本的要求一般要求新生儿标本为不抗凝血；母亲标本为抗凝血。标本量4-5ml。3.母婴标本的血型检测 取母婴的洗涤红
37、细胞、血清（血浆）按常规方法做ABO、Rh血型鉴定。4.新生儿标本的检查新生儿溶血病患儿标本须做下面三项试验：直接抗球蛋白试验游离IgG抗体测定放散试验5.母亲标本的检查IgG抗-A、抗-B效价的测定ABO意外抗体的检查有关血型抗原的检查二、常用的红细胞血清学技术（一）红细胞血清学的免疫学基础（二）标本（三）盐水介质凝集试验（四）胶体介质凝集试验（五）酶处理细胞的凝集试验（六）抗球蛋白试验（七）微柱凝胶试验（八）聚凝胺的运用（九）抗体效价滴定（十）吸收放散试验（十一）凝集抑制试验（十二）新生儿溶血病的免疫学检查（十三）免疫性溶血病输血反应的调查（十三）免疫性溶血输血反应的调查1.询问病史2.核
38、对患者身份和献血者血液3.初步试验4.进一步检查5.与非免疫性溶血反应的区别1.询问病史输血性溶血反应:发生此种反应大多系ABO血型不合输血所致，其次为Rh系统血型及ABO系统以外血型不合输血，亦有部分为输入质量不高之同型血，或血中加入高渗或低渗溶液等引起。病人可有典型溶血性输血反应症状：寒战、发热、心悸、胸痛、腰背痛、呼吸困难；亦可仅有以广泛渗血及凝血障碍为主要表现；更有以突然发生休克为唯一症状者。病史：包括输血史、妊娠史、有关疾病史和用药史。2.核对患者身份和献血者血液 包括核对患者的血样标签和献血者血液标本标签；再次询问患者身份和检查血袋上的标签等，若未发生不一致的地方，立即进行下一步的
39、检查。3.初步试验比较输血前后患者血浆的颜色；抗球蛋白试验：直抗阳性是免疫性溶血反应的证据。4.进一步检查复核血型：对患者输血前的样本和血袋内的剩余血或者连在血袋上的分段管内的血进行ABO、Rh血型的复核；以及检查输血后病人样本的ABO、Rh血型。重做交叉配血试验：患者输血前的样本和输血后病人样本分别与血袋内的剩余血或者连在血袋上的分段管内的血进行交叉配血试验，包括IgG抗体的检测。抗体鉴定和相应抗原的检测：如果检出抗体阳性的标本，进一步用谱细胞鉴定其特异性。一旦确定，再检查有关血型系统的表型。4.进一步检查辅助检查：尿血红蛋白、含铁血黄素、以及血未结合胆红素、结合珠蛋白等的检测。追踪试验：以
40、后每天、每隔几天做直接抗球蛋白试验和抗体筛查，可以发现免疫性溶血反应的证据。5.与非免疫性溶血反应的区别血液在体外溶血：由于保存、运输或加温等不当造成溶血；或在血袋内加了某种药物；输血器材输用过低渗溶液等可以引起溶血。细菌污染：细菌污染的血液也会引起溶血、发烧、血压下降、DIC等严重症状。其白细胞会增高，血样涂片及细菌培养会检出细菌。患者本身有溶血性疾病：通过询问病史可得到明确。三、血清学检测的注意事项标本的确认及处理，必要时重新取样红细胞悬液的处理及浓度，血清和红细胞的比例正确的孵育时间和温度仔细观察并记录全部试验结果正确的解释结果定型试剂（包括标准红细胞）的质控对Rh（D）抗原检查阴性者进行复查，及时对其血清进行抗筛检查并记录结果。全程质量控制四、血库实验室工作的几点体会现代输血工作是科学性、技术性、责任性极强的专业工作；提高输血疗效、保障输血安全必须提高业务和技术水平；正确掌握配合性输血的各项试验技术；通过不断地学习实践，提高自己的专业知识、技术和技巧能力，做到及时正确的处理所遇到的血型血清学疑难问题；加强合作，共同努力！THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢