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1、神经细胞体外培养神经细胞体外培养方法及应用方法及应用田东萍田东萍汕大医学院病理教研室汕大医学院病理教研室神经细胞体外培养的历史神经细胞体外培养的历史n神神经经组组织织的的体体外外培培养养方方法法是是由由HarrisonHarrison，于于19071907年年首首创的。创的。n由由于于该该方方法法具具有有简简化化细细胞胞生生化化环环境境、明明确确生生长长条条件件、便便于于施施加加实实验验因因素素及及容容易易获获得得活活体体直直接接观观测测结结果果等等优优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。n九九十十余余年年来来，这这项项技技术术已已从
2、从组组织织块块（或或植植块块）培培养养（explant explant cultureculture）发发 展展 到到 分分 离离 细细 胞胞 培培 养养(dissociated dissociated cell cell culture)culture)，并并逐逐渐渐与与多多种种现现代代技技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。n 组组织织块块培培养养分分离离细细胞胞培培养养甚至单一型细胞培养甚至单一型细胞培养神经组织的植块培养法神经组织的植块培养法n悬滴培养方法悬滴培养方法n单盖玻方法单盖玻方法n双盖玻方法双盖玻方法1925n改良双盖玻方法
3、改良双盖玻方法n培养物：培养物：CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段灰质、白质、外周神经节或神经小段突起突起非神经元外伸非神经元外伸优点优点n 所需培养液量少，可反应组织代谢中所需培养液量少，可反应组织代谢中微量生化改变微量生化改变n保留了植块内组织特征保留了植块内组织特征不足不足n 培养空间小，培养空间小，O2CO2供少供少n培养空间湿度难以控制，水分会蒸发培养空间湿度难以控制，水分会蒸发n密封手续繁杂，不利更换培养液，难密封手续繁杂，不利更换培养液，难以观察单个神经元生长。以观察单个神经元生长。神经元的分离细胞培养方法神经元的分离细胞培养方法1956年，年，Nakai首创了神经组织的分离
4、培养方法首创了神经组织的分离培养方法材料来源：胚胎动物神经组织材料来源：胚胎动物神经组织n神经元增殖发生于胚胎期神经元增殖发生于胚胎期n形形态态学学分分化化和和化化学学分分化化程程度度低低，体体外外存存活活强强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。部位：部位：部位：部位：灰质、灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大神经节，神经元集中，密度大神经元的体外培养液神经元的体外培养液n 天然合成成分天然合成成分血清血清血浆血浆胚胎撮液胚胎撮液n人工培养基人工培养基n无血清培养基无血清培养基化学限定性培养基化学限定性培养基n常用的：常用的：DMEM+添加剂
5、添加剂F12葡葡萄萄糖糖 为为神神经经元元能能量量代代谢谢主主要要来来源源 3333mmmmCOCO2 2 NaHCONaHCO3 3缓缓冲冲系系统统重重要要 HEPESOHEPESO2 2耗耗量量更更高高K K+神神经经元元生生理理活活动动的的重重要要离离子子，K K+是是神神经经元元存存活活所所必必需需的的，K K+24.5mM 24.5mM 能能提提高高神经元存活，促分化神经元存活，促分化非神经元成分的抑制非神经元成分的抑制 有有 2-3 2-3天天 神经元无血清限定培养液神经元无血清限定培养液人人工工合合成成的的培培养养基基虽虽然然具具备备了了细细胞胞生生长长的的基基本本营营养养物物质
6、质和和无无机机盐盐类类，但但仍仍无无法法满满足足不不同同类类型型细细胞胞的的特特殊殊需需要要。大大多多数数神神经经元元在在基基础础培培养养液液中中即即使使能能够够存存活活也也为为期期不不长长，更更难难以以分分裂裂。因因此此可可根根据据神神经经元元的的特特性性，给给基基础础培培养养中中再再添添加加某些特殊物质。某些特殊物质。选择添加剂的基本过程选择添加剂的基本过程n限定连续细胞系的体外生长条件。限定连续细胞系的体外生长条件。n 试定该细胞系来源的细胞的培养试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件液条件。BottensteinBottenstein实验室经过长期研究发实验室经过长期研究发现如下添加剂比
7、较好现如下添加剂比较好 人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到加入到F F1212与与DMEM 1:1DMEM 1:1混液中，可以代替血清混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠添加物，用来培养大鼠CNSCNS的成神经细胞瘤细的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为别为N N1 1、N N2 2、N N3 3。NN1 1的配方为的
8、配方为n胰岛素胰岛素5g/mln转铁蛋白转铁蛋白5g/mln孕酮孕酮20nMn腐胺腐胺100Umn硒硒30nM神经体外培养的生长基质神经体外培养的生长基质n胶胶元元n多聚赖氨酸多聚赖氨酸nLN神经细胞培养操作程序表神经细胞培养操作程序表 脊髓后根节脊髓后根节大脑皮质大脑皮质孕孕1820天大鼠胚胎天大鼠胚胎新生新生13天大鼠天大鼠在在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜液中取出组织除去脑膜与与CMF-Hanks液一起移至离心管液一起移至离心管舍弃舍弃CMF-Hanks液，再加入液，再加入5ml0.25%胰蛋白酶和胰蛋白酶和5滴滴0.2%Dnase液液370C，30min舍弃胰蛋白酶，加入舍弃胰
9、蛋白酶，加入5ml培养液和培养液和10滴滴Dnase液液用巴斯德吸管吹打用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次次若有组织残渣，将上清移至新试管再加若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打培养液反复吹打将细胞悬液收集于离心管，离心将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min，8min，舍去上清，向沉舍去上清，向沉淀加培养液，离心淀加培养液，离心1200r/min，8min加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1101107 7种入涂有种入涂有poly-D-lysinepo
10、ly-D-lysine的盖片上，每片的盖片上，每片5050ll放入放入CO2孵箱中过夜孵箱中过夜次日加次日加3ml培养液培养液2 2天后（培养的第三天）换入有天后（培养的第三天）换入有DNADNA合成阴断剂的培养液合成阴断剂的培养液 神经元的分离培养过程神经元的分离培养过程大鼠大脑皮层神经组织细胞培养大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源组织来源n新生大鼠新生大鼠1-2日龄，碘日龄，碘酒酒，洒精消毒。，洒精消毒。n断断头头，取取出出大大脑脑，分分离离脑脑膜膜，夹夹取取两两侧侧大大脑脑皮皮质质放放入接种培养液中，用入接种培养液中，用D-Hanks冲洗二遍。冲洗二遍。nmm3,用用D-Hanks充分
11、洗去残血充分洗去残血n加加入入5-10倍倍量量0.25%胰胰蛋蛋白白酶酶，移移入入离离心心管管中中放放到到水水370C浴箱中消化浴箱中消化20-25分钟。分钟。n终终止止消消化化离离心心洗洗涤涤2000转转/分分，5分分钟钟弃弃上上清清。吹吹打打制成细胞悬液。制成细胞悬液。n台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。孔板中。n370C5%CO2培养培养2天后换生长培养液天后换生长培养液大鼠海马神经细胞培养方法大鼠海马神经细胞培养方法 神经元体外生长特征神经元体外生长特征接种密度与体外存活率接种密度与体外存活率n 当当96孔孔每每孔孔2000-300
12、0个个或或7000-10000个个/cm2几乎无神经元存活几乎无神经元存活ncm2存活率最大。存活率最大。n3天天后后不不到到接接种种的的一一半半，故故研研究究某某一一生生长长因因子子前前3天加药最好天加药最好神经元的体外存活时间神经元的体外存活时间n短短1-2Wn长长4个月个月体外分化标志体外分化标志n破伤风毒素破伤风毒素nNSEnNF200,NF160神经细胞的特殊染色鉴定方法神经细胞的特殊染色鉴定方法n尼氏体染色尼氏体染色焦油紫焦油紫甲苯胺蓝甲苯胺蓝硫瑾等组化染色硫瑾等组化染色n镀银染色镀银染色nNADPH-d特异性神经组织化学法特异性神经组织化学法神经细胞培养的应用神经细胞培养的应用应
13、用领域应用领域研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响1.化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。2.药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子（bFGF），），神经营养因子神经营养因子3.细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。4.各种生理
14、病理状态下神经元状态改变各种生理病理状态下神经元状态改变实验方法实验方法研究手段及测量指标研究手段及测量指标1.形态学观察：形态学观察：光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触电镜：超微结构。电镜：超微结构。2.激光共聚焦扫描显微镜（激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope,LCSM)：研究细胞内成分变化，离子改变研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建等，三维重建3.膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。研究手段及测量指标研究手段及测量指标4.
15、聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化5.染色：苏木素染色：苏木素-伊红（伊红（HE）染色及尼氏（染色及尼氏（Nissl)染色，免疫组化染色。染色，免疫组化染色。6.显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。长度及胞径。7.荧光光度分析仪：荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的法测定细胞的OD值值培养神经细胞的观察和鉴定培养神经细胞的观察和鉴定1.1.神经细胞培养存活的标志：种植神经细胞培养存活的标志：种植2424小时后贴小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多
16、都能存活。能存活。2.2.特殊培养阶段：培养的特殊培养阶段：培养的9 9到到1212天之间，有较多天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互相形成网络，电镜下可见突触。互相形成网络，电镜下可见突触。3.3.形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突细长均匀，直径恒定。细长均匀，直径恒定。研究范围研究范围n细胞凋亡细胞凋亡n细胞生长状态细胞生长状态n存活率存活率n膜流动性膜流动性n基因产物表达基因产物表达n细胞内酶活性细胞内酶活性n细胞内离子含量变化细胞内离子含量变化n细胞表面受体，等等细胞表面受体，等等放映完毕放映完毕请多指教请多指教