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1、神经细胞体外培养方法及应用,田东萍汕大医学院病理教研室,神经细胞体外培养的历史,神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首创的。由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（explant culture）发展到分离细胞培养(dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。,组织块培养分离细胞培养甚至单一型细胞培养,神经组织的植块培养法,悬滴培养方法单盖玻方法双盖玻方法 19
2、25改良双盖玻方法培养物： CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段 突起 非神经元外伸,优点,所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化改变 保留了植块内组织特征,不足,培养空间小，O2 CO2供少 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 密封手续繁杂，不利更换培养液，难 以观察单个神经元生长。,神经元的分离细胞培养方法,1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法材料来源：胚胎动物神经组织神经元增殖发生于胚胎期形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大,神经元的体外培养液,天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液
3、人工培养基 无血清培养基 化学限定性培养基 常用的：DMEM + 添加剂 F12,葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mmCO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2耗量更高K+ 神经元生理活动的重要离子，K+是神经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能提高神经元存活，促分化非神经元成分的抑制 有 2-3天,神经元无血清限定培养液,人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。,选择添加剂的基本过程,限定连续细胞系的体外生
4、长条件。 试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件。,Bottenstein实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好,人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到F12与DMEM 1:1混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为N1、N2、N3。,N1的配方为,胰岛素5g/ml 转铁蛋白5g/ml 孕酮20 nM 腐胺100Um 硒30nM,神经体外培养的生长基质,胶 元 多聚赖氨酸 LN,神经细胞培养操作程序表,脊髓后根节 大脑皮质 孕1820天大鼠胚胎
5、 新生13天大鼠 在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜 与CMF-Hanks 液一起移至离心管 舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液 ,370C，30min舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8min，舍去上清，向沉淀加培养液，离心1200r/min，8min,加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1107种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50l
6、放入CO2孵箱中过夜次日加3ml培养液2天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液,神经元的分离培养过程,大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源新生大鼠1-2日龄，碘 酒 ，洒精消毒。 断头，取出大脑，分离脑 膜 ，夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用D-Hanks冲洗二遍。剪碎，0.5-1mm3,用D-Hanks充分洗去残血加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水370C浴箱中消化20-25分钟。终止消化离心洗涤 2000转/分 ，5分钟弃上清。吹打制成细胞悬液。台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。370C 5%CO2培养2天后换生长培养液,大鼠海马神经细胞
7、培养方法,神经元体外生长特征接种密度与体外存活率 当96孔 每孔2000-3000个 或 7000-10000个/cm2几乎无神经元存活 当8000-12000个/96孔 或 2.8万-4万个/cm2 存活率最大。3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前3天加药最好,神经元的体外存活时间,短1-2W 长 4个月,体外分化标志,破伤风毒素 NSE NF200,NF160,神经细胞的特殊染色鉴定方法,尼氏体染色 焦油紫 甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色 镀银染色 NADPH-d特异性神经组织化学法,神经细胞培养的应用,应用领域研究各种因素对神经的影响1. 化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，
8、自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。2. 药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如 中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子 （bFGF），神经营养因子3. 细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。4. 各种生理病理状态下神经元状态改变,实验方法,研究手段及测量指标1. 形态学观察： 光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触 电镜：超微结构。2. 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建3. 膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。,研究手段及测量指标,4. 聚丙烯
9、酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化5. 染色：苏木素-伊红（HE）染色及尼氏（Nissl)染色，免疫组化染色。6. 显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。7. 荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的OD值,培养神经细胞的观察和鉴定,1. 神经细胞培养存活的标志：种植24小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。2. 特殊培养阶段：培养的9到12天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互相形成网络，电镜下可见突触。3. 形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突细长均匀，直径恒定。,研究范围,细胞凋亡 细胞生长状态 存活率 膜流动性 基因产物表达 细胞内酶活性 细胞内离子含量变化 细胞表面受体，等等,放映完毕,请多指教,