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1、四种分子标记技术在寄生虫分类四种分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用鉴定上的应用 汇报人：舒凡帆汇报内容汇报内容1.RAPD:随机扩增多态随机扩增多态DNA2.AFLP：扩增片段长度多态性：扩增片段长度多态性3.SSCP：单链构象多态性单链构象多态性原理原理4.STRs or SSRs：微卫星：微卫星RAPD（random amplified polymorphic DNA）1990 年年William 等等和和Welsh 等在两个实验等在两个实验室同时室同时报道了一种新的报道了一种新的DNA指纹方法指纹方法分别取名为分别取名为RAPD 和随意引物和随意引物PCR。RAPD原理原理一条随即寡核
2、苷酸引物（一条随即寡核苷酸引物（10bp）对总）对总DNA进行进行PCR扩增，引物虽随即，但在总扩增，引物虽随即，但在总DNA上总会有特定位点。上总会有特定位点。1级位点级位点次级位点次级位点无效位点无效位点RAPD原理原理如果2个一级位点位于一条DNA链2条互补链上，呈方向重复序列，且长度小于2kb，便能扩增。不同基因组不同基因组DNA总是一定差异的，所以用总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，引物，复杂
3、性越高复杂性越高的基因组所产生的的基因组所产生的扩增扩增条带数也越多。条带数也越多。RAPD原理原理RAPD 技术与PCR 技术区别引物可随机合成和随机选定引物可随机合成和随机选定，长度一般为，长度一般为9-10 个核苷酸；个核苷酸；随机扩增引物是随机扩增引物是单个加入单个加入，而不是成对，而不是成对(正、正、反向引物反向引物)加入加入。其次，其次，随机引物短，由于随机引物较短，随机引物短，由于随机引物较短，退火温度较低，一般为退火温度较低，一般为35-45。RAPD优点引物的引物的随机性随机性引物的引物的通用性通用性极大的极大的探测性探测性：可以在对物种没有任何分可以在对物种没有任何分子生物
4、学研究的情况下，对其进行子生物学研究的情况下，对其进行DNA多多态性态性分析分析高效性高效性：可在短期内获得大量的多态性可在短期内获得大量的多态性DNA片段片段，能反映整个基因组的变化能反映整个基因组的变化技术简单，容易掌握技术简单，容易掌握，不需要复杂的准备，不需要复杂的准备工作工作RAPD缺点稳定性差稳定性差，由于单链引物随机结合在众多，由于单链引物随机结合在众多反向重复序列上，因而每次得到的实验结反向重复序列上，因而每次得到的实验结果不可能一致果不可能一致高度的变异性高度的变异性，即使亲缘关系非常近的物，即使亲缘关系非常近的物种问结果也有很大差异种问结果也有很大差异解链温度低的随机引物解
5、链温度低的随机引物，易受到外界条件，易受到外界条件影响影响AFLP分子标记技术原理分子标记技术原理1 1：不同物种的基因组不同物种的基因组DNADNA大小不同大小不同，基因，基因组组DNADNA经限制性内切酶酶切后，经限制性内切酶酶切后，产生分子量产生分子量大小不同的限制性片段。大小不同的限制性片段。2 2：对基因组酶切片段的对基因组酶切片段的选择性扩增选择性扩增，将获，将获得的扩增片段通过得的扩增片段通过电泳电泳分离检测，根据带分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出型中一些特征条带的出现或消失，检测出不同扩增片段长度的不同扩增片段长度的多态性多态性。AFLP分子标记技术方法分子
6、标记技术方法 1:使用两种不同的限制性内切酶对整个基因组使用两种不同的限制性内切酶对整个基因组DNA进行酶切反应进行酶切反应.2：将所得的两端具有不同黏性末端的酶切片段与特将所得的两端具有不同黏性末端的酶切片段与特异的人工接头在异的人工接头在T4连接酶作用下进行连接，用作连接酶作用下进行连接，用作PCR扩增反应的模板。扩增反应的模板。3：用带有选择性碱基的特异引物对模板进行用带有选择性碱基的特异引物对模板进行PCR选择性扩增，用于选择性扩增，用于PCR扩增的引物的不同决定了扩增的引物的不同决定了哪些片段能够被扩增。哪些片段能够被扩增。4：为使得扩增效果更好，反应一般分两步进行，即为使得扩增效果
7、更好，反应一般分两步进行，即预扩增和选择性扩增预扩增和选择性扩增5：最后将获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚最后将获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳再经丙烯酰胺凝胶电泳再经EB染色或银染后，清晰染色或银染后，清晰呈现片段长度的多态性。呈现片段长度的多态性。AFLP引物包括三部分：5端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension，EXT)。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板.用含
8、有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性.只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增.扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性.AFLP优点AFLP 结合了结合了RFLP 的稳定性及的稳定性及PCR 的敏的敏感性感性不需要事先知道不需要事先知道DNA 序列资料序列资料;稳定可靠稳定可靠;可用于任何来源或复杂的目的可用于任何来源或复杂的目的DNA。为什么要检测突变1，是为弄懂人类遗传性疾病分子机制，以便有效的预防，诊断和治疗，但是更多的是用于分析不同生物基因型
9、与表型的关联2，对于野生型与突变体总DNA序列分析费时，昂贵，所以应该先扫描，在测序。SSCP:单链构象多态性原理此法的原理是此法的原理是:在在非变性非变性凝胶基质中凝胶基质中,单股单股DNA 分分子的电泳迁移率取决于其结构子的电泳迁移率取决于其结构(构象构象)及大小及大小.由于核苷酸之间的由于核苷酸之间的碱基配对碱基配对,使单股使单股DNA 分子发分子发生二级及三级构象生二级及三级构象,这些构象取决于单股这些构象取决于单股DNA 分分子的长度、碱基组成、碱基配对区的位置及数量子的长度、碱基组成、碱基配对区的位置及数量在最佳条件下在最佳条件下,即使在某一特定位置的一个即使在某一特定位置的一个碱
10、基变碱基变化亦可改变分子构象化亦可改变分子构象,从而导致电泳从而导致电泳受排阻大小不同不同迁移率的单股不同迁移率的单股DNA 带可从电泳胶上切或进行带可从电泳胶上切或进行PCR 再扩增并测序再扩增并测序,以确定核苷酸变异以确定核苷酸变异。和和正常电泳图片的对比正常电泳图片的对比，寻找突变。，寻找突变。单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.SSCP方法取阳性取阳性PCR产物产物10微升微升 加等加等量量的
11、载样缓的载样缓冲液冲液(95%甲酰胺、甲酰胺、2O mmolI EDTA、003%二甲苯蓝、二甲苯蓝、005%溴酚蓝溴酚蓝)94变性变性5 min后立即置于冰盒中后立即置于冰盒中2 min复复性性。形成一定空间结构的单链形成一定空间结构的单链DNA分子。分子。取取35 微升微升混合后的样品经胶电泳混合后的样品经胶电泳810 h凝胶照片凝胶照片。SSCP使用条件质量分数质量分数5%12%的的非变性非变性聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶中加入体积分数胶中加入体积分数5%10%的甘油可以提的甘油可以提高分辨质量分数高分辨质量分数5%12%的的非变性非变性聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶中加入体积分数酰胺凝胶中加入体积
12、分数5%10%的甘油的甘油可以提高分辨可以提高分辨保持温度恒定保持温度恒定碱基数在碱基数在200bp左右最好左右最好SSCP局限性只能作为一种突变检测方法，要最后确定只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格电泳条件要求较严格;可能会出现当某些位置的点突变对单链可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子分子立体构象的改变不起作用立体构象的改变不起作用或作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.但是百但是百分之分之9
13、0的突变都可以检测出来。的突变都可以检测出来。微卫星微卫星微卫星DNA(mierosatellite DNA)，PCR扩增后通过产生等位基扩增后通过产生等位基因数目的不同长度的差异等，经过电泳，不同等位基因数目的不同长度的差异等，经过电泳，不同等位基因之间可以发生分离。因之间可以发生分离。微卫星微卫星DNA是由是由25个核苷酸重复序列所构个核苷酸重复序列所构成的核心部分（重复）及侧翼序列（定位）构成成的核心部分（重复）及侧翼序列（定位）构成短小串连重复序列短小串连重复序列(short tandem repeats，STR)简单重复序列简单重复序列(simple repeats sequence
14、，SRS或或SSR)重复序列重复序列很很短，一般只有短，一般只有1 bp6 bp、长、长度仅为几百个度仅为几百个bp。在原核生物与真核生物中分布比较均匀在原核生物与真核生物中分布比较均匀。随着每个重复单位碱基长度的增加随着每个重复单位碱基长度的增加微卫星微卫星位点数减少位点数减少其其3种类型种类型：单一单一:(AT)n 复合型复合型:(GT)n(AT)m 间断型间断型:重复序列中有其它核苷酸夹杂其中，重复序列中有其它核苷酸夹杂其中，如如(GT)nGG(GT)m。微卫星DNA 两端的序列多是相对保守的，所以亲缘关系相近的物种间是保守的，而且在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定的相似
15、性。通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度,导致微卫星突变率高。微卫星通常是复等位（MHC）的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。与其他标记技术相比Russell 等对几种分子生物学方法进行了比较，AFLP、RFLP 与RAPD 多态性片段分别为36.4%、83.2%和66.3%。微卫星DNA 标记呈共显性的孟德尔式遗传，能够鉴别杂合体，对隐性性状的选择十分有利。微卫星突变率在不同物种、同一物种的不同位点、同一位点的不同等位基因间存在很大的差异，但对于同物种决定相同表型的等位基因，其序列在正常情况下是衡定不变的。同种不同等位基因之间存在着一定的差异这些差异微卫星重复序
16、列在物种之间具有一定的保守性群体遗传学研究与遗传图谱的构建1：用于基因群体流动态势，不同种族微卫星基因座（染色体上的一点或一段（越长越容易失败）等位基因的不同频率与分布就代表不同的种族。2：微卫星DNA技术可以构建遗传图谱（同一染色体上两个基因相对距离，越远，减数分裂后共同遗传的可能越小），作用：计算遗传病概率。3：用于动物的遗传分析来区分不同性状的家系和近交的纯合率（版纳微型猪）法医学研究和亲子鉴定微卫星等位基因在任何两个个体之间几乎不可能一样(同卵双胞胎除外)。所以微卫星DNA在法医学和亲子鉴定上体现其重要价值。动植物遗传育种和濒危野生动物的保护群体的变异情况，比较它们之间的差异获得更丰富
17、的基因遗传信息。优良性状的挖掘保护优良性状和品种鉴定，可选育优良品种和基因资源了解濒危野生动物的种群结构、大小，微卫星在日本血吸虫方面的研究1：不同宿主的研究比较(兔，鼠，狗，猫，猪，牛，羊)2：日本血吸虫发育不同阶段的研究比较（雌雄虫，毛蚴，尾蚴）毛蚴阶段包含所有的基因位点。3：人工感染的尾蚴和自然条件下感染的尾蚴的研究比较（野外株和实验室保存株之间的平均杂合度有极大的差异，疫苗研制的瓶颈）微卫星DNA 位点的获得(1)利用已发现的微卫星位点寻找新的位点利用已发现的微卫星位点寻找新的位点：对同属、科、目的不同物种也可以对同属、科、目的不同物种也可以使用异使用异种引物扩增微卫星种引物扩增微卫星
18、。（2）经典分子生物学方法克隆所需要的微经典分子生物学方法克隆所需要的微卫星位点卫星位点：构建：构建DNA 文库、筛选克隆片文库、筛选克隆片段、段、测序和根据序列设计测序和根据序列设计PCR 的引物以进行微的引物以进行微卫星位点卫星位点由于毛蚴(或尾蚴)DNA含量非常低，1个毛蚴(或尾蚴)仅能进行单个微卫星位点研究，但具有取材方便、省时、结果可靠等优点引物的特异性测定LOI在所有用于检测的线虫上，均产生大小为200bp的扩增产物，说明LOI对剑属线虫来说没有任何特异性；进行的测试中，L02没有产生扩增产IJO1产生了200bp大小的产物L02也产生了250bp大小的产物，由于L02对美洲剑线虫
19、，亚群组外的其他线虫没有扩增产物(图4)，证明LO2引物是美洲剑线虫亚群组水平上的特异性引物微卫星作用微卫星作用1：很微量的：很微量的DNA（纳克），濒危的、或只（纳克），濒危的、或只能非损能非损伤性取样伤性取样。2：亲子鉴定，计算遗传距离，建立树状图：亲子鉴定，计算遗传距离，建立树状图微卫星缺点1：微卫星的筛选过程繁杂。目前微卫星的筛选是通过克隆和杂交技术进行的,从大量的重组质粒中筛选出合适的微卫星DNA 耗时较长、比率较低。如684 个阳性重组质粒中筛选到8 条淡色库蚊的微卫星序列,比率为1.14%(宋锋林,2004);埃及伊蚊微卫星DNA 的筛选比率为3.34%(Huber et al.,1999);多斑按蚊的筛选比率为115%(Rongnoparut et al.,1996)。需要高分辨率的检测方法,理论上最高分辨率应达到分辨出一个碱基的差别.目前常用的PAGEP银染技术，但过程复杂,这就给大样本量的检测带来了一定的难度(Huttle et al.,1999