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1、分子标记技术及其应用分子标记技术及其应用 张莎莎主要内容分子标记相关概念分子标记技术分子标记技术的应用 一 分子标记 所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的较为理想的一种遗传标记。 1.1分子遗传标记 从广义上，是指可遗传并可检测的DNA序列或蛋白质 从狭义上，是指DNA标记，这个界现在别广泛采纳 具有分辨率好和信息量大等优势的分子遗传标记目前已广泛应用于生物基因组研究以及生物遗传育种、进化起源、分类等诸多方面。1.2DNA分子标记的定义及特征 定义：指能反映生物
2、个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异 特征：不受环境和其他因素的影响； 多态性几乎遍布整个基因组；不受基因表达与否的影响，具有数量丰富、多态性强及操作简单等特点二 DNA分子标记技术及其应用 第一代分子标记技术 第二代分子标记技术 第三代分子标记技术 几种新型分子标记技术2.1第一代分子标记技术 以Southern杂交为核心的分子标记技术 RFLP标记是最具代表性的一代分子标记技术，也是最早应用的DNA分子标记技术 原理：用已知的限制性内切酶酶解样品DNA，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，再经同位素或地高辛
3、标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，放射自显影，显示出不同材料的多态性图谱RFLP标记技术的特点 RFLP标记呈现共显性遗传 缺点：步骤繁杂，工作量大，且DNA的需要量大，在很大程度上限制了该技术的应用2.2 第二代分子标记技术第二代分子标记技术主要分为两类基于PCR的DNA分子标记基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记随机引物PCR标记限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性特异引物PCR标记对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性RAPDISSRSSRSTSAFLPCAPS随机引物PCR标记 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，
4、DNA随机扩增多态性） RAPD具有技术简单、检测迅速、灵敏度高、特异性强、检测容易、DNA样品用量少的优点，但RAPD为显性遗传，侧你在共迁移问题，并且重复性较差 RAPD技术原理：利用随机引物（810个碱基）通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究随机引物PCR标记 ISSR（Inter simple Sequence Repeats,内部简单重复序列） ISSR基本原理利用人工合成的1618个核苷酸重复序列作为引物，对SSR之间的DNA片段进行PCR扩增 ISSR在引物设计上比SSR简单，无需知道DNA序列就可用引物扩增，还比RFLP、RAP
5、D、SSR提供的遗传信息更多，但多数情况下，不能区别一个位点扩增的DNA片段特异引物PCR标记 SSR（Simple Sequence Repeats,简单重复序列） SSR基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率特异引物PCR标记 STS（Sequence tagged Site，序列标记位点） STS是将RFLP的标记技术转化为基于PCR的方法，通过设计一对长度约20bp的特异引物，对基因组DNA进行扩增
6、STS标记技术，一旦获得引物，就和RAPD一样简单迅速限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性AFLP AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态性） AFLP基本原理：对DNA限制性酶切片段进行选择性扩增 AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传 AFLP兼具RAPD与RFLP优点，有较高的稳定性对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性CAPS CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,放大剪切序列多态性） CAPS是在RAPD技术的基础上发展起来的 CAPS标记为共
7、显性遗传 CAPS标记使用的引物长，因此可重复性高，比其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好2.3 第三代分子标记技术 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记 SNPs（Simple Nucleotide Polymorphisms,单核苷酸多态性） 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，从分子水平上单个核苷酸的差异进行检测具有重要意义 检测SNPs方法a.随机扩增DNA（RAPD）法 b.DNA芯片（DNA-chip）检测法2.4几种新型分子标记 RGAs标记（Resistance Gene Analogs,抗病基因类似物） RMAPD标记（random micr
8、osatellite amplify polymorphic DNA,随机微卫星扩增多肽） SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性） TRAP标记（Target Region Amplified Polymorphism,靶位区域扩增多态性）三 分子标记技术的应用应用遗传多样性的分析亲缘关系的研究分子标记辅助选育遗传连锁图谱的构建3.1遗传多样性的分析 遗传多样性（genetic diversity）一般指品种间及品种内个体在DNA水平上的差异 通过对遗传多样性的评估，可以了解品种的遗传结构及遗传关系 如：AFLP分析大黄鱼
9、野生种群和养殖群体；RAPD技术对3个中国花鲈群体4个日本鲈鱼群体进行了遗传分化研究；微卫星技术对东南亚海区鲈鱼进行分析，推翻了东亚地区只有1种鲈鱼的说法3.2 亲缘关系的研究 利用DNA分子标记位点的多态性，以多个标记位点在一定群体中各等位基因的频率为基础，计算父子关系相对机会(RCP)来进行血缘鉴定和血缘控制 例：微卫星标记可以应用于中国对虾的家系鉴定（微卫星标记分析表明4个微卫星标记可以鉴定95的后裔，5个微卫星座位的累积排除率可以达到96以上）3.3 遗传连锁图谱的构建 连锁图谱（linkage map），又称遗传图谱（genetic map）或遗传连锁图谱（genetic linkage map），是指基因或DNA分子标记在染色体上的相对位置 绘制遗传连锁图的方法有很多，但是 DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增3.4 分子标记辅助选育 分子标记辅助选育（Marker Assisted Selection，缩写为MAS）是将分子标记应用于生物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段 形态学性状鉴定弊端很多（周期长、环境影响）谢谢WPS OfficeMake Presentation much more funWPS官方微博kingsoftwps