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1、实验五 血红蛋白含量的测定、血型鉴定实验目的l掌握血红蛋白的测定方法；l学习鉴定血型的基本方法，观察红细胞凝集现象，掌握ABO血型鉴定的原理。测定血红蛋白的意义n人血红蛋白参考值 成年男性：13-15克/dl；成年女性：11-14克/dl；儿童：（依年龄而异）12-14克/dl。n临床意义：大致与红细胞增减相似。高原地区居民的血红蛋白浓度一般比平原居民为高，这是机体对低气压环境的一种适应现象。一般来说，在疾病状况下，血红蛋白的增减是与红细胞的改变相平行的，即引起红细胞增多的疾病，也会使血红蛋白含量增加。使红细胞减少的疾病，也使血红蛋白含量减少。在贫血时，血液中的红细胞数量和血红蛋白浓度都有不同
2、程度的下降，但不一定按相同的比例变化。有时红细胞数量可以减少很多，而血红蛋白的浓度的降低却相对地不那么显著，见于大细胞性贫血，由于单个红细胞所含的血红蛋白量较正常者为多。相反，也有的红细胞减少得不很多，而血红蛋白浓度却显著降低，例如缺铁性贫血，这是由于每个红细胞的血红蛋白含量比正常明显减少，故血红蛋白减低的程度较红细胞减少更为显著。依据检验结果，分析病因，做到准确的诊断和治疗都是很必要的。基本原理基本原理 n血红蛋白是红细胞的主要成分，在正常情况下，每个红细胞均含有一定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白质。血红蛋白除能与氧结合形成氧合血红蛋白外，尚能与某些物质作用形成多
3、种血红蛋白衍生物。它们具有特定的色泽和吸光谱，在临床上，可用以诊断某些变性血红蛋白血症和血红蛋白的定量测定。n测定血红蛋白含量的方法很多，实验常用比色法。其原理是在一定量的血液中，血红蛋白经少量盐酸的作用，使亚铁血红素变成高铁血红素，呈现较稳定的棕色。用水稀释后与标准色比较，求出每100ml血液中所含的血红蛋白克数。正常成年男子每100ml血液平均含，女子为。实验原理-血型鉴定n血型一般指红细胞的血型，是根据红细胞膜外表面存在的特异性抗原（镶嵌于红细胞膜上的糖蛋白和糖脂）来确定的，这种抗原或凝集原是由遗传决定的。n抗体或凝集素存在于血清中，与红细胞的不同抗原起反应，产生凝集，最后溶解，由于这种
4、现象，临床上在输血前必须注意鉴定血型，以确保安全输血。ABO血型鉴定实验原理n抗原抗体反应在ABO血型系统中，红细胞膜上抗原分A和B两种抗原，而血清抗体分抗A和抗B两种抗体。A抗原加抗A抗体或B抗原加抗B抗体，则产生凝集现象从而测知受试者红细胞膜上有无A或/和B抗原判断血型n抗体在相邻的红细胞表面抗原决定簇之间搭桥抗体在相邻的红细胞表面抗原决定簇之间搭桥形成肉眼可见的颗粒状凝集团块形成肉眼可见的颗粒状凝集团块.见图见图IgM抗体凝集红细胞示意图IgM抗体凝集红细胞示意图 IgGM在盐水介质中产生凝集实验材料n血红蛋白计、盐酸溶液；血红蛋白计、盐酸溶液；n载玻片、刺血针、牙签、一次性采血管、载玻
5、片、刺血针、牙签、一次性采血管、A A型和型和B B型标准血清、生理盐水、酒精棉球型标准血清、生理盐水、酒精棉球等。等。方法与步骤-血红蛋白测定n于测定管内加入盐酸溶液至百分刻度20处。n取20l被检血液,迅速将吸血管插入测定管底部盐酸液中，缓慢挤出血液，再吸取上部清液，反复冲洗吸血管23次，并混匀，静置10min。n沿着管壁加入蒸馏水，逐步稀释至与标准色柱色调一致后，读取重量（或百分）刻度值报告结果。v 标准制换算：血红蛋白标准制换算：血红蛋白(g/L)=血红蛋白血红蛋白(g/dl)10方法与步骤方法与步骤-血红蛋白测定血红蛋白测定 n血红蛋白计包括 标准比色架，架的两侧镶有两个棕色标准玻璃
6、色柱。血红蛋白稀释管，有方形也有圆形的。两侧有刻度，一侧以g为计数单位，对侧以百分率计，按我国情况，是以每100ml血液内含血红蛋白为100%。20mm3血红蛋白吸管，还有玻璃棒、滴管。n用滴管加于血红蛋白稀释管内，到刻度10处。n用刺血针刺破指尖采血，血滴宜大些。用血红蛋白吸管的尖端接触血滴，吸血至刻度20ul处（）。方法与步骤方法与步骤-血红蛋白测定血红蛋白测定 n用滤纸片或棉球擦净吸管口周围的血液，将吸管插入血红蛋白稀释管的盐酸内，轻轻吹出血液至管底部，反复吸入并吹出稀释管内上层的盐酸，洗涤吸管多次，使吸管内的血液完全洗入稀释管内。摇匀或用小玻璃棒搅匀后，放置10min，使盐酸与血红蛋白
7、充分作用。n把稀释管插入标准比色架两色柱中央的空格中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于透光和比色。n用滴管向稀释管内逐滴加入蒸馏水（每加一滴要搅拌），边滴边观察颜色，直至颜色与标准玻璃色柱相同为止。稀释管上液面的刻度读数即为每100ml血液血红蛋白的克数。n从指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理盐水的小试管内，混匀，即得约5红细胞悬液。采血时应注意先用75酒精消毒指尖或耳垂。)(取少量受检者红细胞（约0.20.5 ml）用生理盐水洗涤3次，然后加入适量生理盐水调配成5%浓度。方法与步骤-血型鉴定方法与步骤-血型鉴定n（1）取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用记号笔标明A及
8、B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。n（2）用滴管吸取红细胞悬液，分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。n（3）竹签两头分别混合，搅匀。用两根 分别用来混合A型和B型标准 （4）观察结果。如有凝集反应可见到呈红色点状或小片状凝集块浮起。先用肉眼看有无凝集现象，肉眼不易分辨时，则在低倍显微镜下观察，如有凝集反应，可见红细胞聚集成团。n（5）判断血型 根据被试者红细胞是否被A，B型标准血清所凝集，判断其血型。血型判定正定型正定型反定型反定型 结果结果抗抗A A 抗抗B BA A型型RBC BRBC B型型RBC ORBC O型型RBCRBC-+-O+-+-A-+-B+-AB注意
9、事项注意事项 n吹血液入稀释管及洗净吸管时，不宜用力过猛。n蒸馏水需逐滴加入，多做几次比色，以免稀释过量。每次比色时，应将搅拌用的玻璃棒取出，以免影响比色。n由于操作过程过长而造成吸管内血液凝固，堵塞管孔时，则要按下列溶液的顺序重复冲洗吸管，即用水95%酒精乙醚或丙酮。五 注意事项n玻片、试管都要标记！玻片、试管都要标记！，A及B标准血清绝对不能相混,不要依靠用染料颜色标记血清。工作中要形成自己的习惯！n所用玻片、试管实验前必须清洗干净，以免出现假凝集现象。n红细胞悬液滴管头不能接触标准血清液面，竹签一端去混匀一侧就不能去接触另一侧。n一般先加血清，然后再加红细胞悬液，便于核实是否漏加血清。n离心时间、速度严格要求，以防假阳 性或假阴性结果。n试验用血清和试剂红细胞都应标准化。n要在光亮的背景下观察凝集,可使用光镜检查小的凝集,同时应注意观察凝集强度，有助于A、B亚型的发现，观察后立即记录观察结果。