《实验七血红蛋白和血型的测定.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验七血红蛋白和血型的测定.ppt（23页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、人体血红蛋白和血型的测定人体血红蛋白和血型的测定实验（七）实验（七）前言血红蛋白是红细胞的主要成分，除作为血液缓冲物质而血红蛋白是红细胞的主要成分，除作为血液缓冲物质而发挥作用外，其功能是在肺部结合氧气，送到全身各组织并发挥作用外，其功能是在肺部结合氧气，送到全身各组织并将组织中的二氧化碳送到肺部而呼出体外。将组织中的二氧化碳送到肺部而呼出体外。n血红蛋白分子是一种由血红蛋白分子是一种由亚铁血红素和珠蛋白结合而亚铁血红素和珠蛋白结合而成的结合蛋白，由四个亚基成的结合蛋白，由四个亚基构成，分别为两个构成，分别为两个亚基和两亚基和两个个亚基。血红蛋白的贮氧、亚基。血红蛋白的贮氧、运氧功能都是依靠血
2、红素中运氧功能都是依靠血红素中的的Fe2+与与O2的配位结合，的配位结合，血红蛋白与氧结合是以协同血红蛋白与氧结合是以协同效应方式进行的。效应方式进行的。n除了运载氧与二氧化碳，血红蛋白还除了运载氧与二氧化碳，血红蛋白还可以一氧化碳、氰离子结合，结合的方可以一氧化碳、氰离子结合，结合的方式也与氧完全一样，所不同的只是结合式也与氧完全一样，所不同的只是结合的牢固程度，一氧化碳、氰离子一旦和的牢固程度，一氧化碳、氰离子一旦和血红蛋白结合就很难离开，这就是煤气血红蛋白结合就很难离开，这就是煤气中毒和氰化物中毒的原理。中毒和氰化物中毒的原理。血红蛋白的含量与年龄、性别、营养状况和生活环境血红蛋白的含量
3、与年龄、性别、营养状况和生活环境等因素有关。等因素有关。正常人与运动员正常人与运动员Hb含量没有明显差异。含量没有明显差异。n初生儿初生儿170一一220g/Ln婴儿婴儿160一一200g/Ln成年女性成年女性110一一150g/Ln成年男性成年男性120一一160g/LHb的含量对运动员的运动能力影响很大，对耐力运的含量对运动员的运动能力影响很大，对耐力运动员的专项素质尤为重要，因此，定期测定动员的专项素质尤为重要，因此，定期测定Hb的含量有的含量有助于了解运动员的营养、对负荷的适应及身体机能水平等助于了解运动员的营养、对负荷的适应及身体机能水平等情况。情况。实验目的实验目的1.掌握掌握72
4、2分光光度计的原理及操作方法；分光光度计的原理及操作方法；2.了解比色法测定的原理；了解比色法测定的原理；3.掌握氰化高铁血红蛋白法的原理；掌握氰化高铁血红蛋白法的原理；4.熟悉移液管的使用及末梢采血的方法；熟悉移液管的使用及末梢采血的方法；5.掌握血红蛋白指标测定的意义及在运动实践掌握血红蛋白指标测定的意义及在运动实践中的应用。中的应用。722分光光度计的原理分光光度计的原理 光是一种电磁波，白光是由不同波长（光是一种电磁波，白光是由不同波长（400760nm）的电磁波按）的电磁波按一定比例组成的混合光，通过棱镜可分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、一定比例组成的混合光，通过棱镜可分解成红、橙、黄
5、、绿、青、蓝、紫等各种颜色相连续的可见光谱。在白光的照射下，物体所以呈现特定紫等各种颜色相连续的可见光谱。在白光的照射下，物体所以呈现特定的颜色，是因为物体对不同波长的光有选择性地吸收所致。不同物质由的颜色，是因为物体对不同波长的光有选择性地吸收所致。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长的光线的吸收能力也不同，因此，每种于其分子结构不同，对不同波长的光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。物质都具有其特异的吸收光谱。T=I/I0其中：其中：T透过率透过率I0I0 入射光强度入射光强度I透射光强度透射光强度A吸光度吸光度K吸收系数吸收系数L溶液的光径长度溶液的光径长度C溶液
6、的浓度溶液的浓度分光光度分析技术的原理分光光度分析技术的原理n 绿 黄 青 橙 白 青蓝 红 蓝 紫 上图对应的两边互为互补光，如将互补的色光相混即产生白光。上图对应的两边互为互补光，如将互补的色光相混即产生白光。1.分光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质及其含量的方法。分光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质及其含量的方法。2.光投射到物体上可被物体吸收或反射，如该物体是透明的则还有部分光可以透光投射到物体上可被物体吸收或反射，如该物体是透明的则还有部分光可以透过。在白光照射下，物体所呈现特定的颜色，就是物体对不同波长的光有选择过。在白光照射下，物体所呈现特定的颜色，就是物体对不同
7、波长的光有选择性的吸收所致。而溶液对某些波长的光的吸收极少而对其他波长的光吸收较多性的吸收所致。而溶液对某些波长的光的吸收极少而对其他波长的光吸收较多,则溶液就呈现这种吸收较少且透过较多光的颜色则溶液就呈现这种吸收较少且透过较多光的颜色(如：硫酸铜溶液对黄光吸收最如：硫酸铜溶液对黄光吸收最强，对蓝光吸收最弱，故在白光的照射下该溶液呈现强，对蓝光吸收最弱，故在白光的照射下该溶液呈现_)，说明任何有色溶，说明任何有色溶液液(或物体或物体)都只对一种单色光有强烈的吸收能力都只对一种单色光有强烈的吸收能力,而对其它波长的光吸收能力较而对其它波长的光吸收能力较弱。弱。比色分析法的基本原理比色分析法的基本
8、原理 比色分析法就是利用被测有色溶液吸收最强的单色光进行比色测比色分析法就是利用被测有色溶液吸收最强的单色光进行比色测定的，这样才能得到最满意的结果。定的，这样才能得到最满意的结果。当一束单色光通过某溶液时，溶液的吸光度当一束单色光通过某溶液时，溶液的吸光度A与吸光物质的浓度与吸光物质的浓度c及液层厚度及液层厚度L成正比，即溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多成正比，即溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多。朗伯朗伯比尔定律：比尔定律：O.D=KLCnO.D=溶液的吸光度溶液的吸光度A（光密度）（光密度）nL=光径（光通过溶液的距离，既比色杯的厚度）光径（光通过溶液的距离，既比色杯的厚度）nC=样品浓度
9、（样品浓度（mol/L）nK=摩尔吸光系数。它表示物质的浓度为摩尔吸光系数。它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。其单位为时，溶液的吸光度。其单位为L/molcmn朗伯朗伯比尔定律是比色分析方法的基本原理。比尔定律是比色分析方法的基本原理。(一)人体血红蛋白的测定实验原理实验原理n nHbHb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白(Hi)(Hi)，HiHi与氰离与氰离与氰离与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白子结合成氰化高铁血红蛋白子结合成氰化高铁血红蛋白子结合成氰化高铁血红蛋白
10、(HiCNHiCN)，它在，它在，它在，它在540nm540nm有一吸有一吸有一吸有一吸收峰，测其光密度而得收峰，测其光密度而得收峰，测其光密度而得收峰，测其光密度而得HbHb的浓度。的浓度。的浓度。的浓度。Hb+KHb+K3 3Fe(CN)Fe(CN)氧化氧化氧化氧化HiHiHi+CNHi+CN合成合成合成合成HiCNHiCN实验试剂和仪器实验试剂和仪器n 试剂：试剂：(1)HiCN(1)HiCN稀释液（稀释液（有毒有毒）（注注：高铁氰化钾法测定血红蛋白比较准确、稳定，是目前国家承认高铁氰化钾法测定血红蛋白比较准确、稳定，是目前国家承认的标准，但试剂中有氰化物，剧毒，在实验进行过程中避免污染
11、，实验的标准，但试剂中有氰化物，剧毒，在实验进行过程中避免污染，实验完毕后注意药品的处理，不能乱倒完毕后注意药品的处理，不能乱倒）(2)75%(2)75%的酒精的酒精仪器：仪器：722722分光光度计、半自动生化分析仪、一次性采血装置、一次性采血分光光度计、半自动生化分析仪、一次性采血装置、一次性采血管（管（2020微升）、消毒棉球、微升）、消毒棉球、5 5毫升试管、移液管毫升试管、移液管 测定管（一次性试管）测定管（一次性试管）测定管（一次性试管）测定管（一次性试管）氰化高铁血红蛋白稀释液氰化高铁血红蛋白稀释液氰化高铁血红蛋白稀释液氰化高铁血红蛋白稀释液5ml5ml5ml5ml酒精消毒手指，
12、并采取新鲜血液酒精消毒手指，并采取新鲜血液酒精消毒手指，并采取新鲜血液酒精消毒手指，并采取新鲜血液20202020 l l l l混匀后放置至少混匀后放置至少混匀后放置至少混匀后放置至少10101010分钟分钟分钟分钟540nm540nm540nm540nm比色比色比色比色,空白调零读取测定管光密度值空白调零读取测定管光密度值空白调零读取测定管光密度值空白调零读取测定管光密度值实验操作步骤实验操作步骤 采血部位必须无炎症、水肿、充血及循环障碍。成人以无名指为宜。采血部位必须无炎症、水肿、充血及循环障碍。成人以无名指为宜。被采血手指的手臂下垂被采血手指的手臂下垂1 1分钟左右，轻轻按摩采血部位，
13、使其自然充血，分钟左右，轻轻按摩采血部位，使其自然充血，用用7575酒精棉球消毒局部皮肤，待干。酒精棉球消毒局部皮肤，待干。紧控刺血部位，用采血针穿刺取血，动作应迅速，深度约紧控刺血部位，用采血针穿刺取血，动作应迅速，深度约2-3mm2-3mm，轻，轻微挤压，以血液能流出为宜。微挤压，以血液能流出为宜。干棉球擦去第一滴血，毛细吸管精确吸血干棉球擦去第一滴血，毛细吸管精确吸血20 l20 l (5)(5)采血完毕，用干棉球压住伤口，血止为止。采血完毕，用干棉球压住伤口，血止为止。(6)(6)拭净毛细管外壁血迹，加入试管中，并将毛细吸血管重复吸洗，混匀拭净毛细管外壁血迹，加入试管中，并将毛细吸血管
14、重复吸洗，混匀采血的过程采血的过程 1 2 3 4 5 6 7 81光源光源2聚光透镜聚光透镜3色散棱镜色散棱镜4狭缝狭缝5比色杯比色杯6光门光门7光电管光电管8检流计检流计722722分光光度计结构示意图分光光度计结构示意图 722722分光光度计的使用分光光度计的使用（1）开启电源，指示灯亮，仪器预热）开启电源，指示灯亮，仪器预热20分钟，选择开关置于分钟，选择开关置于“T”档档（2）旋动波长手轮，将测试所需）旋动波长手轮，将测试所需540nm波长调节至刻度线处。波长调节至刻度线处。（3）打开样品室盖，调节）打开样品室盖，调节“0%T”旋钮，使数字显示为旋钮，使数字显示为“0.00”。（4
15、）以稀释液（不含待测物质的反应液）作为空白，盖上样品室盖，调）以稀释液（不含待测物质的反应液）作为空白，盖上样品室盖，调节透过率节透过率“100%T”旋钮，使数字显示为旋钮，使数字显示为“100.0”,然后将选择开关置于然后将选择开关置于“A”档，用稀释液调消光零。档，用稀释液调消光零。（5）移入待测溶液，显示值即为样品的吸光度）移入待测溶液，显示值即为样品的吸光度A值值。电源开关电源开关选择开关选择开关722型分光光度计型分光光度计波长手轮波长手轮0%T”旋钮旋钮100%T”旋钮旋钮比色杯（皿）比色杯（皿）样品室样品室1.1.采血时，采血针应一人一针，严防交叉感染。采血时，采血针应一人一针，
16、严防交叉感染。2.2.第一滴血弃去不用（为什么？）第一滴血弃去不用（为什么？）3.3.毛细吸管吸血时，避免气泡吸入。否则会使测定结果偏毛细吸管吸血时，避免气泡吸入。否则会使测定结果偏低。若有气泡产生，请使用干棉签吸之低。若有气泡产生，请使用干棉签吸之 。4.4.采血时，动作应迅速，否则易发生凝血现象。采血时，动作应迅速，否则易发生凝血现象。5.5.配制好的配制好的HiCNHiCN稀释液中因氰化钾含量低，毒性不是很稀释液中因氰化钾含量低，毒性不是很大，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混大，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。为防止合，因
17、为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中，氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中，可用可用除毒液除毒除毒液除毒。注意事项注意事项血红蛋白（血红蛋白（mol/L）=测定管光密度测定管光密度/（摩尔吸光系数（摩尔吸光系数液层液层光程光程)血红蛋白（血红蛋白（g/L）=（测定管光密度（测定管光密度血红蛋白分子量）血红蛋白分子量）/（摩尔吸光系数（摩尔吸光系数液层光程液层光程)稀释倍数稀释倍数=测定管光密度测定管光密度（64456/44000）251=测定管光密度测定管光密度367.7式中：式中：（1）64456是目前国际公认的血红蛋白分子量。是
18、目前国际公认的血红蛋白分子量。（2）44000是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光系数。尔吸光系数。（3）251是血样稀释倍数。是血样稀释倍数。实验结果计算实验结果计算Hb在运动实践中的应用：在运动实践中的应用：Hb指标主要用于评定某个训练周期或阶段，如根据指标主要用于评定某个训练周期或阶段，如根据1-2周周时间内运动员对运动量和运动强度的反应来评定运动员的机能时间内运动员对运动量和运动强度的反应来评定运动员的机能状态等。状态等。Hb在运动训练中的变化是多因素综合作用的结果，如仅从在运动训练中的变化是多因素综合作用的结果，如仅从运动负荷的影响看
19、，大运动量训练期间系统测试血红蛋白，可运动负荷的影响看，大运动量训练期间系统测试血红蛋白，可能会出现以下三种类型：能会出现以下三种类型：（1）训练初）训练初Hb下降，经一段训练后，下降，经一段训练后，Hb又逐步回升。又逐步回升。（2）训练初）训练初Hb下降，经一段训练后，始终未出现回升。下降，经一段训练后，始终未出现回升。（3）训练期间，）训练期间，Hb无显著变化。无显著变化。（1）表示运动量安排适宜；（）表示运动量安排适宜；（2）、（）、（3）则分别由于运）则分别由于运动量过大，过小而未能出现血红蛋白的正常变化趋势。因此，动量过大，过小而未能出现血红蛋白的正常变化趋势。因此，测试测试Hb的含
20、量，对于评定运动员的机能状态和运动训练水平的含量，对于评定运动员的机能状态和运动训练水平等具有重要的意义。等具有重要的意义。（二）（二）ABO血型的鉴定血型的鉴定血型的概念：是指血细胞上特异凝集原的类型。血型的概念：是指血细胞上特异凝集原的类型。ABO血型的分类依据血型的分类依据血型血型红细胞上的凝集原红细胞上的凝集原血清中的凝集素血清中的凝集素AA抗抗BBB抗抗AABA、B无无O无无抗抗A、抗、抗B备注：红细胞表面上含凝集原，血清中含凝集素备注：红细胞表面上含凝集原，血清中含凝集素（一）实验目的原理：（一）实验目的原理：通过用标准血型抗体对红细胞膜上通过用标准血型抗体对红细胞膜上ABO系系统
21、血型抗原的鉴定，掌握统血型抗原的鉴定，掌握ABO系统定型的基本操系统定型的基本操作方法，判读技能。作方法，判读技能。根据根据lgM类特异性血型抗体与红细胞上特异类特异性血型抗体与红细胞上特异性抗原结合能够出现凝集反应的原理。性抗原结合能够出现凝集反应的原理。即：凝集原与其相对应的凝集素相遇时将会发生凝即：凝集原与其相对应的凝集素相遇时将会发生凝集反应集反应例如：例如：凝集原凝集原A+抗抗A凝集反应凝集反应ABO血型的测定血型的测定抗抗B血清血清A 型B 型AB 型O 型抗抗A血清血清n（二）实验器材：（二）实验器材：n 采血器具、玻片、玻棒、抗A抗B血型定型试剂n（三）实验步骤：（三）实验步骤
22、：（玻片法）n1.在白纸上分别注明“抗A”“抗B”字样，并放上玻片，分别滴12滴血型定型剂；2.采血，与前一实验同期进行，用玻棒两端各蘸取12滴血分别与抗A抗B血型定型剂搅匀，定置。3.观察是否有凝块并判断血型。n注意事项：注意事项：n1、采血应采用正确的采血方法。n2、严格消毒，并保证玻片、玻棒的清洁。根据最近所从事的运动及运动量的大根据最近所从事的运动及运动量的大小，并结合自己的专项来说明自己的实验小，并结合自己的专项来说明自己的实验结果，用实验结果来评定自己的身体机能结果，用实验结果来评定自己的身体机能状态，需要怎样去调整。若数值偏大或偏状态，需要怎样去调整。若数值偏大或偏小，原因是什么？说出理由。小，原因是什么？说出理由。课后小结课后小结