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1、微生物实验微生物实验1 1微生物学实验室规则微生物学实验室规则v进入实验室必须穿白大衣、戴帽子。进入实验室必须穿白大衣、戴帽子。v书本、文具放在抽屉里。书本、文具放在抽屉里。v实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头脸等部位。要用手抚摸头脸等部位。v凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处理，不得随便乱放或用水冲洗。理，不得随便乱放或用水冲洗。v一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。
2、v离开实验室前，必须洗手。怀疑污染应及时用离开实验室前，必须洗手。怀疑污染应及时用11新洁而灭泡手。新洁而灭泡手。v每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖把拖地以后每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖把拖地以后再扫地，实验室用紫外线灯照射再扫地，实验室用紫外线灯照射1 1小时。小时。1500W 1500W电炉电炉安全警告安全警告培养基沸腾溢出培养基沸腾溢出流入电炉：流入电炉：触电触电危及生命！危及生命！短路短路断电，断电，。蒸馏水：蒸馏水：配制培养基。11新洁而灭：新洁而灭：怀疑病原菌污染，泡手35分钟。消毒液：消毒液：擦拭实验台台面。玻片缸：玻片缸：浸泡用过的载玻片。医学微
3、生物学实验综合性实验一 v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（P2）培养基的制备P2消毒与灭菌P5细菌的人工培养无菌技术（录像）摆斜面，倾注平板。常见病原性球菌的检查程序常见病原性球菌的检查程序P47P47：直接涂片、革兰染色、镜检直接涂片、革兰染色、镜检脓汁、痰、咽部分泌物脓汁、痰、咽部分泌物 观察菌落性状、溶血性、色素观察菌落性状、溶血性、色素 血琼脂平板培养血琼脂平板培养 涂片染色镜检涂片染色镜检 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 生化反应生化反应 纯培养纯培养 动物实验动物实验 药敏实验药敏实验血液、穿刺液血液、穿刺液 肉汤增菌培养肉汤增菌培养 培养液涂片染色境检培养液涂片染色境检 常见肠道致病菌的
4、检查程序常见肠道致病菌的检查程序P48P48：粪便粪便 SS SS琼脂、伊红美蓝平板培养琼脂、伊红美蓝平板培养 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 血清学鉴定血清学鉴定 血、骨髓血、骨髓 增菌培养增菌培养 双糖铁培养基双糖铁培养基 染色镜检染色镜检 生化反应生化反应 v从培养基的制备，细菌的分离、纯化、形态学检查，到细菌的生化试验、血清学试验和药敏试验，全都由同学们亲自动手操作和完成。v综合性实验是一个连续的过程，一个步骤，一个环节的失误，将直接影响到最终实验结果。v实验时应严格按要求操作，实验结果要及时观察，及时记录，以便撰写实验论文（报告）。培养基的制备组号组号培养基培养基称量称量(g)(g)水量水
5、量(ml)(ml)煮沸煮沸(次次)分装分装(ml)(ml)备注（备注（08 08药学）药学）1 1氯化钠氯化钠1.31.31501503 35050支，小试管，盐水支，小试管，盐水营养琼脂营养琼脂11.411.43003004 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂3.43.490903 35 51818支，中试管，斜面支，中试管，斜面5 57 7营养肉汤营养肉汤1.21.255551 13 31818支，小试管，液体支，小试管，液体8 81010半固体半固体1.61.655553 33 31818支，小试管，高层支，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基
6、，勿作标记！培养基的制备组号组号培养基培养基称量称量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸(次次)分装分装(ml)(ml)备注（备注（4040人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.411.43003004 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.72.770703 35 51414支，中试管，斜面支，中试管，斜面5 57 7营养肉汤营养肉汤1.11.150501 13 31414支，小试管，液体支，小试管，液体8 81010半固体半固体1.51.550503 33 31414支，小试管，高层支，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！培
7、养基的制备组号组号培养基培养基称量称量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸(次次)分装分装(ml)(ml)备注（备注（5050人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.411.43003004 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂3.43.490903 35 51818支，中试管，斜面支，中试管，斜面5 57 7营养肉汤营养肉汤1.21.255551 13 31818支，小试管，液体支，小试管，液体8 81010半固体半固体1.61.655553 33 31818支，小试管，高层支，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！培养基的制备组号
8、组号培养基培养基称量称量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸(次次)分装分装(ml)(ml)备注（生物技术）备注（生物技术）1 13 3营养琼脂营养琼脂2.32.360603 35 51212支，中试管，斜面支，中试管，斜面4 45 5营养肉汤营养肉汤1.11.150501 13 31616支，小试管，液体支，小试管，液体6 68 8半固体半固体1.21.240403 33 31212支，小试管，高层支，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！1500W 1500W电炉电炉安全警告安全警告培养基沸腾溢出培养基沸腾溢出流入电炉：流入电炉：触电触电危及生命！危及生命！短路短路断
9、电，断电，。边台柜子内器材边台柜子内器材:架盘药物天平、砝码架盘药物天平、砝码,细菌干细菌干粉培养基粉培养基,锥形瓶，量筒锥形瓶，量筒,试管试管筐，筐，灭菌平皿（第一组）。灭菌平皿（第一组）。锥形瓶用后洗净、包装。锥形瓶用后洗净、包装。器材放回原处，依次摆整齐。器材放回原处，依次摆整齐。边台抽屉内器材：边台抽屉内器材：试管（棉塞），刻度吸管，洗耳试管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，称量纸，药勺，硫酸纸、牛球，称量纸，药勺，硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋皮纸、橡皮筋,尺子。尺子。药勺、吸管用后洗净，放回原处。药勺、吸管用后洗净，放回原处。称量纸置于左盘，游码称量纸置于左盘，游码移至标尺左端移至标尺左端“0”
10、“0”点位置点位置上，指针应对准中线，取得上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。整螺母旋动调节平衡。秤物时秤物时“左物右码左物右码”，物，物品在左盘上，砝码在右盘，品在左盘上，砝码在右盘，尽可能放在秤盘中心。天平尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清洁。保持干燥、清洁。培养基培养基 培养基是用人工的方法，将多种营养物质，根据各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种营养制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水，pH7.47.6。v培养基制备的一般程序：调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存。干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定 保存。v培养基的
11、制备原则：(1)适当的营养成分,(2)合适的酸碱度,(3)配制后必须灭菌。v培养基的种类（按物理性状分类）液体培养基:不含凝固剂（琼脂），用于增菌，纯培养。固体培养基:含12琼脂，用于分离培养,纯培养。半固体培基:含0.30.5琼脂，用于动力检测,保种。液体培养基液体培养基 固体斜面培养基固体斜面培养基 半固体培养基半固体培养基v培养基的种类（按用途分类）基础培养基:含一般细菌生长繁殖所需的基本营养成分，可作为一些特殊培养基的基础成分。如普通平板。营养培养基：在基础培养基中加入血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长。如血平板。增菌培养基：促进目的菌的生长，适
12、用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。选择培养基：在培养基中加入抑制剂抑制杂菌生长，有助于目的菌的生长，如EMB、SS平板。鉴别培养基：利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用来试验细菌的生化反应、代谢产物，如糖发酵管。厌氧培养基：用于培养厌氧菌。v培养基的灭菌基础培养基：121高压蒸汽灭菌1530分钟。含糖培养基：115灭菌15分钟。鸡蛋、牛奶培养基:75100间歇灭菌3次(1天1次)。不耐高温的液体成分：滤菌器滤过除菌（EK型蔡氏滤器、G5或G6玻璃滤器、0.45um或0.22um微孔滤膜）v固体培养基的制备（灭菌以后）平板：培养基冷却5060，以无菌操作，
13、倾注平皿10ml（直径7厘米平皿），琼脂凝固以后形成琼脂平板。平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。斜面：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。平板的制备平板的制备培养基倾注平皿时，温度越高，冷凝水越多。培养基倾注平皿时，温度越高，冷凝水越多。水分蒸发平皿盖小水滴大水滴 培养基吸收 水滴扩散 平板表面如果平板表面有水滴，细菌可随水流扩散，如果平板表面有水滴，细菌可随水流扩散，弥散生长，形成菌苔。弥散生长，形成菌苔。做细菌培养时，平板为什么要倒置？做细菌培养时，平板为什么要倒置？防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。防止冷凝
14、水滴于平板表面，影响单菌落形成。防止平板水分丢失。防止平板水分丢失。防止杂菌污染。防止杂菌污染。怎样检查培养基是否合格?无菌试验：将灭菌后的培养基置于35培养箱培养24小时，无任何细菌生长为合格。效果试验：将已知的标准参考菌株，接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。卧式圆形压力蒸汽灭菌器YXQ.WY21Dv灭菌器主要由灭菌室、管道系统、电器系统和蒸汽发生器构成。v蒸汽发生器电压380伏，功率12千瓦。灭菌室结构采用双层单门不锈钢制造，两层之间为夹层。v锅炉的蒸汽通过管道直接进入夹层，储存高温饱和蒸汽，预热灭菌室。经电磁阀电磁阀控制进入灭菌室。v灭菌室的冷空
15、气通过冷凝阀冷凝阀以冷凝水的形式排出。灭菌器的设置 v安全阀安全阀：当蒸汽压力超过最高允许使用压力时能自动跳起，释放超压蒸汽，确保安全使用。v压力表压力表：灭菌室和蒸汽套层各装有压力表一只，能指示各层内的蒸汽工作压力。v温度表温度表：能随时显示灭菌室内最低灭菌温度，有利操作。v冷凝水泄出器冷凝水泄出器：能将灭菌室内的冷空气和冷凝水在灭菌过程中予以排出，确保灭菌效果。v安全联锁装置安全联锁装置：灭菌室压力降到零，蜂鸣器声响，提示可以安全开门。高压蒸汽灭菌器的操作程序v冷空气冷空气的排除：灭菌室压力升至0.07MPa时，关关进汽阀，开开排汽阀，使压力降到零，排汽一次。然后关关排汽阀，开开进汽阀，重
16、复以上操作。如此反复三次，方可排净冷空气。冷空气的排除是灭菌成功和失败的关键。v物品的灭菌：一般维持1530分钟。v排除蒸汽。v灭菌物品的干燥（根据需要）。热蒸汽热蒸汽比冷空气大概轻一倍，浮在上层，把冷空气挤压到底部，经排气管道排出。高压蒸汽灭菌器冷气出口蒸汽入口热气流热气流冷气流冷气流常用蒸汽压力与相应温度常用蒸汽压力与相应温度v压力(磅/吋）压力（Kpa）相对温度()8 55.16 112.6 10 68.95 115.2 15 103.43 121.3 20 137.90 126.21标准大气压=76厘米汞柱高=1.013105帕斯卡=14.696磅/英寸2。采用2000个大气压也不能杀
17、死细菌，真正起杀菌作用是高温。灭菌所需时间、压力与温度指标灭菌所需时间、压力与温度指标 灭菌物品类 灭菌时间(分)蒸汽压力Mpa 相对温度v含糖培养基：15 0.07 115v基础培养基：1530 0.11 121v橡 胶 类 15 0.11 121v敷 料 类 3045 0.110.14 121126v器 皿 类 15 0.110.14 121126v器 械 类 10 0.110.14 121126v瓶装溶液类 2040 0.110.14 121126细菌生长繁殖的方式和速度v细菌繁殖方式：以二分裂方式进行无性繁殖。v繁殖速度：多数2030分钟繁殖1代，结核杆菌1820小时繁殖一代。v细菌生
18、长繁殖曲线细菌的生长曲线细细菌菌数数目目的的对对数数培养时间培养时间（小时）（小时）5 10 15 20 25 30 6.06.57.07.58.08.59.0活菌数活菌数总菌数总菌数迟缓期迟缓期对数生长期对数生长期稳定期稳定期衰退期衰退期细菌生长曲线意义v迟缓期：一般14h，细菌代谢活跃，但不繁殖。v对数期：维持4 8h，细菌快速繁殖，数目呈几何级数增加，细菌形态、染色性、生理活性最典型、对抗生素最敏感。细菌鉴定选用此期为佳。v稳定期：通常维持10h，活菌数和死菌数几乎相等，代谢产物形成较多。v衰亡期：培养18 24 h以后，代谢逐渐停滞,死菌数超过活菌数。常用玻璃器材的处理程序（示教）v新
19、购置的玻璃器材：12盐酸浸泡过夜中和游离碱 流水冲洗15次晾干包装灭菌。v无污染器皿:洗涤剂洗刷流水冲洗15次。v微生物污染的器材（消毒、灭菌后再处理）：试管、吸管和平皿：高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布洗刷干净冲洗15次。吸管：3来苏儿浸泡过夜冲洗15次。载玻片：3来苏儿浸泡过夜 肥皂水煮沸10min 流水冲洗15次。玻璃器材洗干净的标准标准v1.洗涤时观察:洗后的玻璃器材附着在内壁上的水不是个别水珠水珠,而是一层极薄的水膜水膜。v2.干燥后观察:对着光亮处观看玻璃器材,非常透明,内外壁上不出现大片发白或白点,也无微小污点和粉末。思考题v人工培养细菌需要提
20、供的条件是什么?v培养基制备的原则是什么?v怎样检查培养基是否合格?v培养基按物理形状分哪几种?各有何用途?v高压蒸汽灭菌法、紫外线、碘酒的杀菌机理各是什么?医学微生物学实验综合性实验一v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（一）培养基的制备P2消毒与灭菌P5细菌的人工培养无菌技术（录像）摆斜面，倾注平板。常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：按接种针、试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火接种环、油性笔和打火机的顺序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源机的顺序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧，使用以后必须放回原处，依次摆整齐。插座一侧，使用以后必须放回原处，依次摆整齐。实验室器材实验室器材 整齐有序整齐有序固体培养基的制备v平板：倾注普通平板505块、伊红美蓝平板20+5块。以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固以后（温度降至室温），平板倒放，4冰箱保存备用。v斜面：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后（温度降至室温），4冰箱保存备用。