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1、微生物实验二细菌的简单染微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色色和革兰氏染色球菌杆菌杆菌 二、实验原理二、实验原理-革兰氏染色革兰氏染色n n革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结结晶紫晶紫进行初染，再用碘液媒染碘液媒染，然后用乙醇乙醇(或丙酮或丙酮)脱色脱色，最后用复染剂用复染剂(如番红如番红)复染复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。二、实验原理二、实验原理-革兰氏染色革兰氏染色n n当用当用结晶紫初染结晶紫初染结晶紫初染结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都
2、被染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物结晶紫一碘的复合物结晶紫一碘的复合物结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的两类细菌的脱色效果是不同的两类细菌的脱色效果是不同的两类细菌的脱色效果是不同的。革兰。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮或丙酮)脱色
3、时细胞壁脱水、脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫紫紫紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处
4、理时，类脂质被乙醇类脂质被乙醇类脂质被乙醇类脂质被乙醇(或丙酮或丙酮或丙酮或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来碘的复合物比较容易被洗脱出来碘的复合物比较容易被洗脱出来碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。被染上复染剂的红色。三、实验器材三、实验器材 n n1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。n n2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。n n3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、9
5、5%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶（香柏油和二甲苯）。四、实验方法和步骤四、实验方法和步骤细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色n n1 1 1 1、涂片：、涂片：、涂片：、涂片：用用1%1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。分混匀涂成薄膜。n n2 2 2 2、干燥：、干燥：、干燥：、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。n n3 3 3 3、固定：、固定：、固定：、固定
6、：涂面朝上，通过微火涂面朝上，通过微火2-32-3次。次。n n4 4 4 4、染色：、染色：、染色：、染色：待玻片泠却后加结晶紫待玻片泠却后加结晶紫1-21-2滴于涂片上，覆盖涂滴于涂片上，覆盖涂面染色面染色1-21-2分钟。分钟。n n5 5 5 5、水洗：、水洗：、水洗：、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。水变无色为止（注：勿冲去菌体）。n n6 6 6 6、干燥：、干燥：、干燥：、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。自然干燥，或用吸水纸吸干。n n7 7 7 7、镜检：、镜检：、镜检：、镜检：油镜观察并
7、绘图。油镜观察并绘图。四、实验步骤四、实验步骤1、菌落形态观察：2、细菌简单染色：3、细菌革兰氏染色。注意：菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、颜色、边缘是否规则等特征。染色过程：涂片干燥固定染色（1min）水洗干燥镜检注意事项：涂片：取菌量不能太大 干燥：自然干燥 水洗：水流不能直接冲在涂菌处滴加少量水滴加少量水挑取菌体挑取菌体涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗干燥干燥2.革兰氏染色革兰氏染色n n1 1）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/41/4处下面用记号笔分别标明处下面用记号笔分别标明S S和和E E（见图示），并（见图示），并滴一滴蒸馏水
8、，分别将金黄色葡萄球菌和大肠滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。杆菌涂布在相应的区域内。2.革兰氏染色革兰氏染色2 2、干燥与固定：方法同（一）中、干燥与固定：方法同（一）中2 2，3 3步骤步骤3 3、染色：、染色：结晶紫染色结晶紫染色1-21-2分钟分钟-水洗水洗-碘液碘液媒染媒染1-21-2分钟分钟-水洗水洗-酒精脱色酒精脱色15-2015-20秒秒-水洗水洗-番红复染色番红复染色2-32-3分钟分钟-水洗水洗-干燥干燥-镜检记录。镜检记录。染色结果染色结果金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果染色结果染色结果大肠杆菌革兰氏染色结果染色结果染色结果金黄色葡萄球菌和大肠杆
9、菌混合菌样的革兰氏染色结果四、实验结果四、实验结果n n绘图记录观察结果显微镜放大倍数物镜放大倍数显微镜放大倍数物镜放大倍数目镜放大倍数目镜放大倍数 思考题思考题n n1、在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？n n2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？附：油镜的使用附：油镜的使用双目显微镜双目显微镜单目显微镜单目显微镜2.2.油镜的原理油镜的原理n n油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的介质折
10、光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。减弱，因此能清楚地看到物象。减弱，因此能清楚地看到物象。减弱，因此能清楚地看到物象。双层瓶双层瓶香柏油香柏油二甲苯二甲苯下一个实验下一个实验n n实验三、学校公共环境微生物的分离与纯化