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1、试验微生物显微镜使用细菌形态观察和细菌革兰氏染色第1页试验目标 1 1）掌握显微镜油镜使用和保护法）掌握显微镜油镜使用和保护法2 2）认识细菌基本形态与特殊结构。）认识细菌基本形态与特殊结构。3 3）掌掌握握细细菌菌涂涂片片标标本本制制备备、革革兰兰氏氏染染色色法法 步骤、细菌革兰氏染色结果。步骤、细菌革兰氏染色结果。4 4）学习无菌操作技术）学习无菌操作技术 第2页试验内容：试验内容：1 1）显微镜油镜使用方法；）显微镜油镜使用方法；2 2）观察细菌基本形态染色装片；）观察细菌基本形态染色装片；3 3）观察几个常见细菌菌落；）观察几个常见细菌菌落；4 4）进行革兰氏染色法操作）进行革兰氏染色
2、法操作 第3页试验原理试验原理 显微镜光学系统中，物镜性能最为关键，影响显微镜光学系统中，物镜性能最为关键，影响显微镜分辨率。显微镜分辨率。显微镜物镜中油镜放大倍数最大，可达显微镜物镜中油镜放大倍数最大，可达100X,100X,油镜使用需在载玻片与镜头之间滴加镜油（香油镜使用需在载玻片与镜头之间滴加镜油（香柏油）。柏油）。油镜基本原理油镜基本原理第4页总放大倍数总放大倍数(物镜放大倍数物镜放大倍数x x目镜放大倍数目镜放大倍数)物镜数值孔径物镜数值孔径 N AN AN A=n sin n n是指介质（空气、浸油等）折射率；是指介质（空气、浸油等）折射率；是孔径角二分之一。是孔径角二分之一。第5
3、页分辨率分辨率显微镜所能分辨两点之间距离显微镜所能分辨两点之间距离分辨率分辨率 /2N.A.=/2 n sin （为所使用光线波长）为所使用光线波长）油镜分辨率为油镜分辨率为油镜分辨率为油镜分辨率为0.2m0.2m左右左右左右左右第6页 油镜使用油镜使用增加照明亮度增加照明亮度 油镜头焦距很短，直径很小，所需光照强油镜头焦距很短，直径很小，所需光照强度最大度最大增加显微镜分辨率增加显微镜分辨率 显微镜性能优劣主要决定其分辨率大小。显微镜性能优劣主要决定其分辨率大小。第7页为何使用香柏油？为何使用香柏油？为何使用香柏油？为何使用香柏油？当物镜与装片间介质是空气（空气折射率当物镜与装片间介质是空气
4、（空气折射率n=1.0n=1.0）时，光线会发生折射，使进入物镜光）时，光线会发生折射，使进入物镜光线降低，降低了视野照明度。线降低，降低了视野照明度。当介质为香柏油时，香柏油折射率（当介质为香柏油时，香柏油折射率（1.521.52）与玻璃相近，光线可经过载片直接进入物镜而与玻璃相近，光线可经过载片直接进入物镜而不发生折射，增加了照明度，更主要是增加了不发生折射，增加了照明度，更主要是增加了数值孔径到达提升分辨率目标。数值孔径到达提升分辨率目标。第8页显微镜使用方法显微镜使用方法第9页显微镜各部分名称显微镜各部分名称第10页第11页第12页第13页第14页第15页第16页第17页油镜维护与保养
5、油镜维护与保养透镜清洁透镜清洁 用无水乙醇和无水乙醚（用无水乙醇和无水乙醚（3:7/4:63:7/4:6）擦拭镜）擦拭镜头。尤其是用完油镜后。头。尤其是用完油镜后。干燥预防生霉干燥预防生霉第18页目标要求目标要求巩固显微镜油镜使用方法巩固显微镜油镜使用方法认识细菌基本形态和特殊结构认识细菌基本形态和特殊结构观察并描绘几个常见微生物基本形态与特观察并描绘几个常见微生物基本形态与特殊结构殊结构微生物形态观察微生物形态观察第19页试验仪器、材料和用具试验仪器、材料和用具显微镜、镜油、镜头纸、擦镜液显微镜、镜油、镜头纸、擦镜液细菌装片：细菌三种基本形态装片及细菌特殊细菌装片：细菌三种基本形态装片及细菌
6、特殊结构结构-芽孢、鞭毛、荚膜装片。芽孢、鞭毛、荚膜装片。第20页细菌基本形态观察细菌基本形态观察（1）观察金黄色葡萄球菌、八叠球菌装片。）观察金黄色葡萄球菌、八叠球菌装片。注意菌体间关系。注意菌体间关系。（2）观察枯草芽孢杆菌、大肠杆菌装片。）观察枯草芽孢杆菌、大肠杆菌装片。（3）观察螺菌装片。注意菌体螺旋。）观察螺菌装片。注意菌体螺旋。第21页 细菌基本形态细菌基本形态第22页Arrangement of Cocci球菌球菌A.arrangement of cocci B.staphylococcus arrangement C.streptococcus arrangementD.sar
7、cina arrangement E.diplococcus arrangement第23页Arrangements of BacilliArrangements of Bacilli牙孢杆菌牙孢杆菌牙孢杆菌牙孢杆菌A.arrangements of bacilli B.single bacillus C.streptobacillus第24页Spiral FormsA.spiral forms B.spirillumC.spirochete(arrows)mixed with red blood cells D.vibrio第25页细菌特殊结构观察细菌特殊结构观察（1）固氮菌（荚膜）装片：注
8、意菌体和荚膜染）固氮菌（荚膜）装片：注意菌体和荚膜染色差异，荚膜大小、以及与菌体关系。色差异，荚膜大小、以及与菌体关系。（2）螺菌（鞭毛）装片：注意鞭毛染色、位置、）螺菌（鞭毛）装片：注意鞭毛染色、位置、数目、形状和大小。数目、形状和大小。（3）巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、破伤风梭）巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、破伤风梭菌装片，注意孢体和菌体染色差异，芽孢形状、菌装片，注意孢体和菌体染色差异，芽孢形状、大小和位置。大小和位置。第26页Capsule stain of Capsule stain of Enterobacter aerogenesEnterobacter aerogenes细菌荚膜
9、细菌荚膜第27页细菌鞭毛细菌鞭毛第28页arrangement of flagellaarrangement of flagella鞭毛鞭毛第29页细菌芽孢细菌芽孢第30页第31页目标要求目标要求掌握细菌涂片标本制备方法及革兰氏染色掌握细菌涂片标本制备方法及革兰氏染色法步骤法步骤识别细菌革兰氏染色结果识别细菌革兰氏染色结果学习无菌操作技术学习无菌操作技术 细菌革兰氏染色细菌革兰氏染色 第32页试验仪器、材料和用具试验仪器、材料和用具(1)(1)显微镜、镜油、擦镜纸、擦镜液显微镜、镜油、擦镜纸、擦镜液(2)(2)结晶紫、革氏碘染液、结晶紫、革氏碘染液、95%95%酒精、番红染液酒精、番红染液(3
10、)(3)载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、(4)(4)枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 液体培养液、牙垢液体培养液、牙垢第33页试验原理试验原理试验原理试验原理第34页试验步骤试验步骤涂片涂片左手持菌液试管左手持菌液试管,右手持接种右手持接种环在火焰中灼烧环在火焰中灼烧,冷却后从试冷却后从试管中取菌液一滴管中取菌液一滴,在洁净载玻在洁净载玻片上做一涂膜片上做一涂膜;从固体斜面或平板上取菌时从固体斜面或平板上取菌时,用无菌接种环取少许菌体用无菌接种环取少许菌体,涂涂抹均匀于玻片上预先滴有一抹均匀于玻片上预先滴有一滴自来水中
11、滴自来水中;第35页干燥干燥在空气中自然干燥在空气中自然干燥第36页用镊子夹住涂片一端用镊子夹住涂片一端,在火焰上连续经过三次在火焰上连续经过三次;以载玻以载玻片在手背上试感觉不烫为宜片在手背上试感觉不烫为宜.固定固定第37页3.3.95%95%乙醇脱色乙醇脱色：滴：滴加加95%95%乙醇，轻轻摇动玻片乙醇，轻轻摇动玻片进行进行脱色脱色，直至直至流出乙醇无紫色时，水洗流出乙醇无紫色时，水洗；染色步骤染色步骤染色步骤染色步骤1.1.结晶紫结晶紫初染初染 ：滴加数滴结晶紫染液滴加数滴结晶紫染液于细菌涂片上于细菌涂片上，染色染色1 1分钟，水洗分钟，水洗；2.2.卢戈氏碘液卢戈氏碘液媒染媒染 ：用用
12、卢戈氏卢戈氏碘液覆盖涂片碘液覆盖涂片1 1分钟，水洗分钟，水洗；4.4.蕃红蕃红复染复染：滴加蕃红染液复染滴加蕃红染液复染2 2分钟分钟以上以上，水洗，水洗，吸干，吸干镜检镜检。第38页第39页载玻片上滴载玻片上滴加一滴香柏加一滴香柏油油，放放油镜油镜下镜下镜检检;注意注意标本中细菌形态标本中细菌形态、大小大小,排列排列,和颜色和颜色镜检镜检染色结果：染色结果：革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌呈呈紫色紫色;革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌呈呈红色红色;第40页金黄色葡萄球菌染色结果金黄色葡萄球菌染色结果第41页讨论讨论统计革兰氏染色结果统计革兰氏染色结果,并描述形状并描述形状,菌体排列和颜菌体排列和颜色色,看
13、看与理论上是否相同看看与理论上是否相同;如不一样如不一样,分析原因分析原因;分析影响革兰氏染色结果原因分析影响革兰氏染色结果原因;牙垢里大约能看到几类菌，哪几个较多？牙垢里大约能看到几类菌，哪几个较多？第42页注意事项注意事项载玻片是否洁净载玻片是否洁净,取菌量、适取菌量、适当菌龄、当菌龄、热固定及每一步水热固定及每一步水洗和酒精脱色程度是试验成功洗和酒精脱色程度是试验成功关键关键禁止把染液倒入水池中禁止把染液倒入水池中,回收回收到废液桶中到废液桶中第43页影响革兰氏染色结果原因影响革兰氏染色结果原因菌龄：取处于对数生长久细菌，此时结果经典。菌龄：取处于对数生长久细菌，此时结果经典。操作：操作
14、：热固定：温度不能太高，不然会造成细菌结构破坏。热固定：温度不能太高，不然会造成细菌结构破坏。染色：染料应过量，防止结晶。染色：染料应过量，防止结晶。初染和媒染：时间在初染和媒染：时间在30-60s30-60s为宜。为宜。复染：时间可稍长复染：时间可稍长脱色：约脱色：约30s30s，以流下脱色液无色为准，以流下脱色液无色为准,不然制片上会不然制片上会留有杂质或造成假阳性或假阴性。留有杂质或造成假阳性或假阴性。水洗：要充分，不然制片上会留有杂质。水洗：要充分，不然制片上会留有杂质。第44页 萋纳氏抗酸染色法萋纳氏抗酸染色法染液：石炭酸复红，染液：石炭酸复红，3盐酸酒精，碱性盐酸酒精，碱性美蓝染液
15、。美蓝染液。菌液：枯草芽孢杆菌菌液：枯草芽孢杆菌器具：显微镜，载玻片，酒精灯，接种环。器具：显微镜，载玻片，酒精灯，接种环。第45页（1 1）用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌液，涂）用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌液，涂于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。（2)2)滴加石炭酸复红液于涂片上，用玻片夹住滴加石炭酸复红液于涂片上，用玻片夹住涂片微火加热，保持染液冒蒸汽约涂片微火加热，保持染液冒蒸汽约5 5分钟，分钟，切勿蒸发至干或使染液沸腾。切勿蒸发至干或使染液沸腾。染色法：染色法：（3 3）冷后，水冲洗。）冷后，水冲洗。第46页（4 4）以）以3 3盐酸酒精脱盐酸酒精脱色，至片上红色全部脱色，至片上红色全部脱去为止。去为止。（5 5）水冲洗后，以碱性）水冲洗后，以碱性美蓝液复染美蓝液复染1 1分钟，水洗，分钟，水洗，待干，镜检。待干，镜检。结果：枯草芽孢杆菌芽孢被染成红色，结果：枯草芽孢杆菌芽孢被染成红色，而菌体则被染成蓝色。而菌体则被染成蓝色。第47页细菌单菌落观察结果细菌单菌落观察结果第48页