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1、微生物生理学（王海洪）微生物生理学（王海洪）7 7调节基因研究副本调节基因研究副本基因表达调控的基本概念细菌代谢调节的层次文本细菌可以在基因表达过程的任何阶段进行调控，一般以转录水平上的调控为主。转录因子（激活蛋白）转录起始过程中RNA聚合酶所需要的辅助因子。转录因子是参与正调控的反式作用因子，在无转录因子时，RNA聚合酶不能起始转录。也被称为激活蛋白。转录因子通常识别位于基因上游启动子附近的顺式作用元件。启动子和终止子位于转录单位开始和结束位置上的DNA序列，称为启动子和终子。两者都是典型的顺式作用元件，能受同一类反式作用因子RNA聚合酶的识别。结构基因编码蛋白质或RNA的任何基因。结构基因
2、编码大量的功能各异的蛋白质，如组成细胞和组织的结构蛋白和酶等。大肠杆菌乳糖操纵子诱导物、辅阻遏物和效应物诱导物：能起始酶诱导合成的小分子物质，如乳糖。它与调节蛋白结合，抑制调节蛋白与操纵基因的结合，进而促进转录。辅阻遏物：能阻止酶合成的小分子物质，如氨基酸和核苷酸等。它与调节蛋白结合，促进调节蛋白与顺式作用元件的结合，进而抑制转录。效应物：诱导物和辅阻遏物都是小分子物质，总称效应物。它们能与调节蛋白结合，并进一步提高或降低调节蛋白与顺式作用元件的结合能力。一般地酶催化的底物通常用做诱导物，而代谢的终产物通常为辅阻遏物。操纵子在原核生物中几个功能相近或相关的结构基因排列在一起，由一个共同的启动子
3、、操纵基因或其他调控序列来调控这些基因的转录。包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。所以一个完整的操纵子主要应包括启动子、操纵基因、结构基因和终止子四个部分。原核生物的调控系统原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为负转录调控(negative transcription regulation)和正转录调控(Positive transcription regulation)。负转录调控系统调节基因编码阻遏蛋白，阻遏蛋白阻止结构基因转录。其作用部位是操纵基因，它与操纵基因结合，转录受阻。可诱导负调控系统阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结
4、构基因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录。可阻遏负调控系统阻遏蛋白单独无活性，当阻遏蛋白与辅助阻遏物结合后，阻遏蛋白被激活，结合操纵基因，结构基因不转录。正转录调控系统在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)，激活蛋白结合与DNA的启动子及RNA聚合酶后，转录才会进行。可诱导正调控系统在可诱导正调控系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行。可阻遏正调控系统在可阻遏正控系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行。乳糖操纵子的研究前期工作大肠杆菌对乳糖的利用需要诱导。异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）不能为大
5、肠杆菌分解，但具有诱导效应。野生大肠杆菌-半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷转乙酰酶经乳糖诱导才能大量产生，即野生型大肠杆菌为诱导型。大肠杆菌对乳糖的利用至少需要三种酶，-半乳糖苷酶（LacZ）、-半乳糖苷透性酶（LacY）和-半乳糖苷转乙酰酶（LacA）。邻硝基苯-D-半乳糖苷（ONPG）能被-半乳糖苷酶分解，产生黄色邻硝基苯亚硝基酚。lacZ突变使-半乳糖苷酶结构发生改变，丧失活性，突变菌株检测不到-半乳糖苷酶活性。乳糖操纵子负调控的研究i 基因组成型和超阻遏型突变在有葡萄糖存在时，大肠杆菌优先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗尽后开始利用乳糖。组成型突变（i-)：培养基中无乳糖存在，突变菌株
6、也能合成大量的-半乳糖苷酶等三种酶。超阻遏型突变（is）：培养基中有乳糖存在，突变菌株也不能能合成大量的-半乳糖苷酶等三种酶。经基因定位发现i基因与Z、Y、A所处位置不同。i基因的突变改变了Z、Y、A的合成方式，而Z、Y、A的突变仅使各自编码的酶蛋白失去活性，但是不影响酶的合成方式。调节基因突变与结构基因突变比较i 基因的作用机制注：突变株的构建是将下游结构基因与lacI+或lacI连接在质粒F上，通过F与F-菌株杂交，形成部分二倍体。i+基因和i基因比较1,2两项：不经诱导i+菌株没有酶活性，而i菌株中有活性。比较3,4两项：杂基因子的行为和i+菌株相同，为诱导型。表明i+对于i是显性。从2
7、项看出i基因具有多效，与Z、Y、A不同。？比较1,2两项可以看出i+基因和Z+基因在对于细胞是否出现-半乳糖苷酶活性上具有相反作用。这表明i基因对于酶的合成起着消极的作用，即阻遏酶的合成。比较3,4两项还可以看到对于i和Z的关系来讲，3是反式而4是顺式，顺反结构没有不同，即没有顺反位置效应。综合上述实验结果，i+基因编码一种阻遏物，能够抑制-半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷转乙酰酶的合成。问题：如何验证上述结论？Hfr i+Z+SsT6s F I Z SrT6r采用大肠杆菌接合，将i+基因引入i突变菌株中，观察酶活性变化。表明i+基因对于Z+基因的作用必然通过某些可扩散的物质，这些物质
8、由i+基因产生。在接合后两个小时内，随菌量增加，-半乳糖苷酶活性逐渐上升，切不需诱导。之后，酶活性不再继续上升。在两小时时添加乳糖，酶活性随时间延长，酶活性逐渐上升。这一实验再次表明i+基因编码阻遏蛋白，在没有乳糖存在时，抑制结构基因的表达，而当乳糖存在时，该蛋白失活，结构基因得以表达。i+基因和is基因如果乳糖与阻遏蛋白相互作用，使之失活，结构基因得以表达，那么应该可以得到另一种调节基因的突变，它所产生的阻遏蛋白结构发生了改变，不能和乳糖接合，而始终抑制结构基因的表达，也就是说它是一种诱导无效的突变型。的确分离到了这样一种突变菌株，即超阻遏突变型，is菌株。3,4两项说明is对 i+或i都是
9、显性。即使细胞中由于i基因存在而产生没有作用的阻遏物或是由于i+的存在而产生能和诱导物结合的阻遏物，都不足以影响is产物的阻遏作用。操纵基因（o）的研究曾经得到一株大肠杆菌对乳糖利用的组成型突变，测得该菌株的三种结构蛋白的酶活性均要比lacI突变低。并发现该菌株的lacI没有发生突变。基因定位显示，突变位点与Z、Y、A相邻，而与lacI相距较远。这表明在大肠杆菌中还有另外一个基因参与诱导酶的合成。该基因便是操纵基因，它的组成型突变写作oc。大肠杆菌操纵基因杂基因子酶的合成比较1,2两项，可以看到oc菌株和i菌株一样为组成型，但是它的作用小于i；o基因是多效的；oc对于o是显性。4项中，oc和Z
10、+处于顺式，Z+为组成型表达；5项中，oc和Z+处于反式，Z+为诱导型表达，且这时 oc对于o是隐性，即存在顺式显性现象。表明操纵基因与结构基因组成一个功能单位，即基因调控单位。o+和i+对于结构基因Z、Y、A都起着一种阻遏作用，所不同的是i+可以作用于在结构上没有联系的结构基因，而o+只作用于邻近位置的结构基因。根据上述实验和分析，可得到这样的结论：o+是i+的作用位点，LacI蛋白通过与o的结合抑制结构基因的表达。oc突变使得LacI不能与之结合，结构基因组成型表达。表中8的结果表明oc不但不能和i+基因产物结合，而且也不能和is突变产物结合。依据这些研究结果F.Jacob和 J.mono
11、d于1961年提出了乳糖操纵子模型，并开创了基因表达调控的研究。乳糖操纵子正调控的研究葡萄糖效应：葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象，又称为降解物阻遏效应。葡萄糖效应研究发现产生这种现象的本质是由于葡萄糖降解物的存在使一种正控制机制不起作用的结果。降解物阻遏突变型（CR）这一突变菌株在含有葡萄糖和乳糖的培养液中能同时利用这两种糖。在含有葡萄糖的培养液中野生型细菌（i+z+y+CR+)的-半乳糖苷酶活性相当于在含有甘油培养液中培养时的48，阻遏程度达52，对组成型细菌（i z+y+CR+）阻遏程度也相仿。可是只要有CR突变，不论是诱导型还是组成型，阻
12、遏程度就降低为0或5。同时CR突变是多效的，且无顺反位置效应。这表明CR属于调节基因。特殊的超阻遏突变在大肠杆菌中曾筛选到一类只能在含有葡萄糖而不能在含有乳糖等其他须经诱导才能被利用的培养液中正常生长的突变型。这类突变型又可分为两种：一种突变型只要在培养液中加入环腺苷酸（cAMP）便能是它的表型恢复正常，这是腺苷酸环化酶结构基因的突变（cya），它位于ilv和met之间。另一种突变型的表型不能为环腺苷酸（cAMP）所恢复，它位于strA和aroB 之间。研究发现这种突变型的细胞中缺少一种能和cAMP结合的蛋白，这种蛋白称为分解代谢物激活蛋白（CAP），即cAMP受体蛋白。突变型CR基因与cap
13、基因占有同一位置，是同一基因编码的两种不同的突变蛋白。CAP蛋白能结合cAMP。CR对于CR+是显性，即CR突变所编码的蛋白在不和cAMP结合时也具有激活作用。综合上述实验结果可得出cap或CR基因编码一种激活乳糖和其他许多操纵子的转录正调控蛋白，cAMP是它的效应物。而葡萄糖的降解物则具有抑制催化cAMP形成的腺苷酸环化酶或促进催化cAMP分解的磷酸二酯酶的作用。细菌调节机制研究枯草芽孢杆菌FapR转录调控因子的研究枯草芽孢杆菌fabHAF操纵元调控区确定1.理论分析A依赖的RNA聚合酶识别位点，-10区和35区。有由17bp组成的反向重复序列。2.实验研究突变菌株构建amyE编码-淀粉酶菌
14、株JH642 amyE:pGES35lacZ表达受fabHAF操纵元调控区（BS3为 trpC spoOA:Em）BS3 amyE:pGES35（JH642为 trpC pheA1）JH642 amyE:pGES35 表达分析JH642 amyE:pGES35BS3 amyE:pGES35spoOA：编码负责芽孢形成的负调控因子调控区在菌体营养阶段表现活性；进入芽孢形成阶段，活性下降。SpoOA对fabHAF操纵元无调节作用。芽孢形成与fabHAF操纵元表达脂肪酸合成抑制与fabHAF操纵元表达Western BlotCerulenin浅蓝菌素，抑制细菌脂肪酸合成表明菌体脂肪酸合成受到抑制时，
15、fabHAF操纵元表达奈啶酮酸，抑制DNA旋转酶，对 fabHAF操纵元表达无影响脂肪酸合成抑制与相关基因表达采用浅蓝菌素和三氯森处理野生枯草芽孢杆菌，制备总RNA，通过Microarray分析脂肪酸合成相关基因表达。表明：当脂肪酸合成代谢受到抑制时，参与脂肪酸合成和磷脂和合成的相关基因表达增加。采用基因转录融合技术分析也证明了这一点。枯草芽孢杆菌fabHAF操纵元调控蛋白的确定凝胶阻滞分析根据蛋白质与特异DNA结合后，可使DNA在聚丙烯酰胺凝胶上的迁移率变慢的特性，而设计的一种研究蛋白质与DNA相互作用的方法。凝胶阻滞分析调控蛋白的初步确定1.PCR扩增并制备fabHAF操纵元上游300bp
16、DNA片段（一种包含17bp组成的反向重复序列，另一种不包含此片段）。2.用32P标记上述两片段。3.制备枯草芽孢杆菌的无细胞抽提物。4.无细胞抽提物与DNA温浴，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。5.放射性自显影，得到结果。表明：300bpDNA片段能与特异蛋白结合。调控蛋白的分离与纯化1.将300bpdeDNA片段与特殊的磁性小珠结合，制备亲合层析填料。2.亲合层析填料与芽孢杆菌无细胞抽提物结合。3.通过洗脱，获得与亲合层析填料结合的蛋白。4.经SDS凝胶电泳分离蛋白，并通过蛋白质微量测序获得蛋白质N端序列。5.根据蛋白质N端序列在枯草芽孢杆菌基因组中搜索相应的基因序列，得到一基因ylpC，命名为
17、fapR。6.根据基因序列克隆fabpR基因，并构建携带His-tag的融合FapR蛋白表达载体，分离纯化蛋白质。（fabD、fabG和acpP编码脂肪酸合成相关蛋白，plsX编码磷脂合成相关酶）调控蛋白的再次确认使用融合FapR蛋白再次做凝胶阻滞分析。表明：FapR能专一性地与启动区域结合，且末其中的17bp反向重复区是结合所必须的。突变菌株构建枯草芽孢杆菌FapR调控机理的研究采用基因敲除技术构建了fapR缺失菌株：GS268(fapR-)克隆fapR基因，构建表达载体：pPHKS-fapR，转化，得到互补菌株GS284(fapR-/pPHKS-fapR）菌株GS283为 GS268携带
18、pPHKS(fapR-/pPHKS)。采用基因融合技术构建了转录融合菌株：GS274：fapR-,amyE-PfabHAF-lacZGS273：fapR+,amyE-PfabHAF-lacZGS278：fapR-,amyE-PfapR-lacZGS277：fapR+,amyE-PfapR-lacZGS282：fapR+,amyE-PfaHB-lacZGS285：fapR-,amyE-PfaHB-lacZfapR突变菌株形状分析1.温度切换分析先在37C培养菌株，然后转移至15C，继续观察菌体生长。表明：fapR突变后菌株对冷敏感。2.突变菌株脂肪酸组成分析表明：fapR突变后菌株合成的长链脂肪酸量增加。3.突变菌株相关基因表达分析fabHAF操纵元的表达fabHB和fapR操纵元的表达表明：FapR为负调控因子。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！43