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1、微生物生理学（王海洪）微生物生理学（王海洪）6细菌细菌结构基因的鉴定副本结构基因的鉴定副本基因鉴定：对某个基因全方位的研究，包括基因序列测定、基因位置分析和基因编码产物生理功能研究。核心是生理功能研究。正向遗传学：首先获得突变菌株，接着确定靶基因，同时研究基因功能。即从生物的性状、表型到遗传物质来研究基因的功能。适用于所有细菌基因功能的研究。研究策略反向遗传学：在获得基因序列的基础上，对靶基因进行必要的改造，得到突变菌株，同时研究基因的功能。即从基因到性状、表型来研究基因功能。适用于已经完成全基因组测序的细菌。研究手段遗传学、分子生物学、生物化学和细胞生物学等研究层次与内容基因、蛋白质和细胞三
2、个层次，体内和体外两个方面内容。中断杂交与染色体图谱 HfrF杂交规律 供体菌染色体在F质粒牵下按一定方向和均匀速度逐渐进入F细胞。DNA转移从F质粒的oriT起始，F质粒的主要部分在最后进入受体。整个染色体进入受体菌约需用100分钟，由于在接合过程中常发生染色体断裂，一般不能将完整的染色体转移进受体菌，因此F菌株不变为F。中断杂交实验：将接合中的细菌按不同时间取样，并将样品放入搅拌器内猛烈搅拌，以打断细菌的接合管，终止接合。由于接合时间不同，不同长度的细菌染色体（基因组）从供体转移到受体，分析受体的基因型即可知细菌染色体的基因转移顺序，以确定细菌染色体上基因位置（包括基因顺序和距离）Hfr
3、a+b+c+d+e+StrsF-a-b-c-d-e-Strr不同时间取样，分别在含有Str和a、b、c、d、e的基础培养基上进行筛选。DNA转移从F质粒的oriT起始，越靠近oriT的基因，越先进入受体菌。从上述实验中可知，基因的排列顺序为baecd不同的Hfr菌株的染色体原点不同，转移方向也不同。从不同的Hfr菌株的各个转移基因之间毗邻关系相同但转移起点及方向不同的事实推断出，大肠杆菌的染色体是环状DNA分子。利用供体基因进入受体细胞的顺序和时间可绘制出细菌的遗传学图。大肠杆菌染色体图谱图距是时间：分钟整个染色体为100分钟。规定了起始0点，顺时针方向。每个基因占据独立的时间位置。约有100
4、0多个基因被标定在这一图谱上。接合与基因定位大肠杆菌一突变株：ace，不能利用乙酸盐为碳源。Hfr1F-(ace)获得原养型接合子1000个。通过突变菌株与几个不同Hfr菌株接合，检测原养型接合子的数量定位ace基因。Hfr2F-(ace)获得原养型接合子50个。Hfr3F-(ace)获得原养型接合子1200个。Hfr4F-(ace)获得原养型接合子200个。ace在85分钟与5分钟之间。转导与基因定位P1噬菌体温和性噬菌体，有两种生活方式：溶原和裂解。溶原状态以环状质粒形式存在于大肠杆菌细胞内，不与大肠杆菌染色体整合。P1噬菌体DNA全长为90kb，约等于大肠杆菌染色两分钟的图距。裂解状态以
5、随机包装方式形成成熟颗粒，能将大肠杆菌的染色体随机地包装进噬菌体颗粒中。转导过程基因定位共转导：一种噬菌体同时将两个或多个供体基因转导进入受体菌的现象。两个基因在染色体上的位置越近，被共转导的频率就越高。在大肠杆菌染色体上相距2分钟之内的基因均有可能被P1噬菌体共转导。受体菌：WTD731，对氯离子敏感（cl-），氨卞青霉素抗性(AmR)。通过接合，定位在大肠杆菌染色体12-17。供体菌：ME8975：zbc-3105:Tn10，13，TcRME8795：zbd-601:Tn10，15，TcRME8451：zbe-280:Tn10，16，TcRME8799：zbh-29:Tn10，18，TcR
6、杂交结果ME8795WTD731 36%ME8451WTD731 40%ME8975WTD731 2%ME8799WTD731 0%重组率（TcR Cl+）根据上述结果目的基因位于根据上述结果目的基因位于15 -16 应用实例构建特殊的大肠杆菌菌株E.coli MH121 fabA:cat，为油酸的营养缺陷型菌株。E.coli YYC1257 cfa:kan，不产生环丙烷十七脂肪酸。构建E.coli fabA:cat cfa:kan。？小结大肠杆菌接合定位确定的基因位置较为粗放，P1转导定位较为准确，更精确定位需使用其它方法。基因定位仅确定了基因的位置，DNA序列仍然未知，由此获得的关于基因功
7、能的信息有限。但是通过基因定位积累的大肠杆菌突变菌株和相关知识对于现在研究大肠杆菌仍有帮助。现代细菌基因鉴定对于未知序列的基因，采用正向遗传学策略，先确定其DNA序列，然后研究其生理功能。对于已知序列的基因，采用反向遗传学策略，构建突变菌株，然后研究其生理功能。现代基因鉴定的实质是生理功能的鉴定。未知序列的基因主要通过筛选突变菌株获得，已知序列基因是指那些全基因组测序完成的细菌中存在的大量未知功能的基因。未知基因的序列鉴定前提条件获得了该基因的突变菌株、已知该基因产物的某些功能、有模式细菌的此类基因的研究结果等。构建基因文库鉴定未知基因基因文库：基因文库是指通过克隆方法保存在适当宿主中的一群混
8、合的DNA分子，所有这些分子中的插入片段的总和，可代表某种生物的全部基因组序列或全部mRNA序列，按此可分为基因组文库和cDNA文库。细菌一般构建基因组文库。细菌基因文库构建要求制备100kb以上的基因组DNA。选择合适的限制性内切酶，部分切割总DNA，回收25-40kb的DNA片段。细菌基因文库一般选用cosmid克隆载体。柯斯载体（cosmid）：一类人工构建的含有噬菌体DNA 的cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。复制子一般为ColE1的，携带抗性基因，如AmpR。有噬菌体的cos序列。有多克隆位点（MCS），大小一般为710kb，能在大肠杆菌中转化和增殖。能携带大小为3045kb的
9、外源DNA片段。体外连接时，外源DNA片段与柯斯载体连接成线性DNA，噬菌体头部包装蛋白识别线性DNA上的两个cos位点，进行包装，产生有感染能力的重组噬菌体颗粒，用于感染宿主细胞。柯斯载体克隆的策略体外包装噬菌体在大肠杆菌体内以滚环形式复制，形成多联体线状DNA，其外壳蛋白能识别cos位点，并将两个cos位点间的DNA包装，形成成熟的噬菌体。研究发现缺失D包装蛋白的噬菌体突变株和缺失E 包装蛋白的噬菌体突变株，均不能单独包装 噬菌体DNA，但将两种突变株分别感染大肠杆菌，从中提取缺失蛋白D的包装物(含E蛋白)和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装噬菌体DNA。目前D包装蛋白和E
10、 包装蛋白已经商品化，可直接用于包装重组DNA，感染宿主大肠杆菌，构建柯斯文库。注意完整的基因文库，必须使任何一个基因进入库内的概率均达99。换句话说，要求在文库内钓取任何一个基因，均有99 的可能性。因此需要估算文库至少包含多少个阳性克隆。用于计算基因文库应有的克隆数（N值），公式如下：Nln(1P)/ln(1f/g)其中，P为从基因文库中选出的任一基因概率，一般定为99（0.99）；f为载体容量（kb）；g为基因组大小（kb）。细菌未知基因的鉴定：遗传互补以鉴定霍乱弧菌烯脂酰ACP还原酶基因（fabV）为例：使用福斯载体（fosmid）和专一性宿主（大肠杆菌EPI300）构建基因文库。福斯
11、载体（fosmid）：pCC1FOS具有一般质粒、F因子和噬菌体的三重特性。携带有F因子单拷贝复制子，可调控的高拷贝复制子和噬菌体的cos位点。像一般柯斯载体一样可进行体外重组和包装，感染大肠杆菌宿主菌后可像F因子一样以单拷贝存在，在诱导条件下可增加拷贝。宿主菌：EPI300专一性地与pCC1FOS匹配，诱导时能提供高拷贝复制子复制所需的TrfA蛋白。EPI300的改造EPI300为烯脂酰ACP还原酶原养型菌株，不宜直接用于筛选霍乱弧菌烯脂酰ACP还原酶基因。大肠杆菌JP1111为烯脂酰ACP还原酶基因（fabI）温度敏感突变菌株，但是不宜直接做为福斯载体的宿主用于基因文库构建。大肠杆菌fab
12、I位于染色体29分钟处，trpC基因位于28.38分钟处。有一菌株CAG18455为trpC:Tn10，四环素抗性。以EPI300 fabI(Ts)trpC:Tn10为宿主构建霍乱弧菌的基因组文库，并在42C筛选可生长的菌株，在经多次亚克隆，得到fabV。细菌未知基因的鉴定：酶活性鉴定遗传互补不仅可以互补大肠杆菌突变菌株，也可以互补其它细菌的相应突变菌株。但是在互补其它细菌时使用的柯斯载体上应该携带能够通过接合转移的基因序列，如pLAFR3。Massengo-Tiasse,R.P.,and J.E.Cronan.2008.Vibrio cholerae FabV defines a new c
13、lass of enoyl-acyl carrier protein reductase.J.Biol.Chem.哈氏弧菌（Vibrio harveyi）中有一种脂酰ACP合成酶，催化脂肪酸直接合成脂酰ACP。编码基因未知。用EPI300和福斯载体构建哈氏弧菌的基因组文库，将文库菌制备无细胞提取物，并检测Aas活性克隆基因。最终获得克隆。Jiang,Y.,C.H.Chan,and J.E.Cronan.2006.The soluble acyl-acyl carrier protein synthetase of Vibrio harveyi B392 is a member of the m
14、edium chain acyl-CoA synthetase family.Biochemistry.细菌未知基因的鉴定：Southern杂交通过一定的技术能获得部分未知基因的序列，如生物信息学能提供该基因的保守序列或者能获得部分蛋白质氨基酸序列等。根据部分基因序列制备标记杂交探针，通过原位杂交获得阳性克隆，确定未知基因。也可以直接用探针与经过适当酶切的总DNA杂交，得到目的片段后再克隆，然后再通过原位杂交获得未知基因。构建随机突变菌库鉴定未知基因用转座子构建细菌随机突变库，从中筛选目的突变菌株。通过构建基因文库，遗传互补确定未知基因。通过质粒拯救，获取未知基因的部分序列，再通过southe
15、rn杂交确定基因序列。应用细菌蛋白质组鉴定未知基因蛋白质组(proteome)：一个细胞在特定生理下表达的所有种类的蛋白质。蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定。二维电泳：将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分析方法。等电聚焦：电荷，SDS凝胶电泳：分子大小。蛋白质质谱分析：对目的蛋白进行适当的处理，然后采用多种质谱分析技术，分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列。根据部分氨基酸序列设计DNA探针，通过适当技术获得基因。已知序列的基因确定目前已经有1000多种细菌的基因组已经测定完成，
16、功能得到鉴定的基因不足10。生物信息学对一些基因进行了注释，但是仍有许多没有任何信息的未知功能的基因。基因注释只是提供了基因具有某种功能的可能的信息，不一定表明这些基因一定有某种生物学功能，因此仍然需要生物化学、遗传学的证据。大肠杆菌基因组有两个编码长链脂酰ACP合成酶的基因：fabB和fabB。而在茄科雷尔氏菌基因组有4个与大肠杆菌fabF同源的基因，1个与fabB同源的基因。如何从众多的基因中选择要研究的基因？应用细菌转录组鉴定未知基因转录组（transcriptom）：一个活细胞所能转录出来的所有mRNA。转录组学（transcriptomics）：一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情
17、况及转录调控规律的学科。研究转录组的一个重要方法就是利用DNA芯片技术检测有机体基因组中基因的表达。DNA芯片（基因芯片）：固定有寡核苷酸、基因组DNA或cDNA等的生物芯片。利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。首先，制备细菌全基因组芯片，接着在不同生理条件下提取mRNA，并标记，然后与芯片杂交，分析杂交结果，确定目的基因。通过同源比较确定未知基因同源基因的判定生物信息学分析，寻找与已知基因同源的未知基因。蛋白序列中有相对保守的活性位点。基因组中该基因附近有参与同一生理活动的其他类似基因。3-酮脂酰ACP还原酶催化的反应大肠杆菌中该酶由唯一
18、的fabG基因编码，茄科雷尔氏菌基因组中有两个同源基因：fabG1（RSc1052），fabG2（RSp0359），它们编码的蛋白与大肠杆菌FabG的同源性分别为65和43。FabG1和FabG2均含有典型的3-酮脂酰ACP还原酶催化中心：Ser-Tyr-Lys和其它保守的氨基酸序列或残基。fabG1和fabG2与细菌脂肪酸合成酶的其它基因组成基因簇。问题：茄科雷尔氏菌中FabG1和FabG2在脂肪酸合成代谢中的功能？通过分析基因簇确定未知基因在原核生物基因组，功能相关的基因有成簇存在，组成一个完整操纵元的特点。肺炎链球菌脂肪酸合成基因簇肺炎链球菌脂肪酸合成酶基因组成一个基因簇，且基因组成完整，包含了主要的脂肪酸合成酶基因。缺少烯脂酰ACP还原酶基因和参与饱和脂肪酸合成的相关基因。生物信息学分析显示fabK为一个未知功能的基因，编码的蛋白有结合FAD位点，推测为一个氧化还原酶，可能具有烯脂酰ACP还原酶功能fabM为另一个未知功能的基因，编码的蛋白属于脱水/异构酶家族，可能参与不饱和脂肪酸合成。HTH也是一个未知功能的基因，编码的蛋白属于MarR转录调控因子家族，可能参与脂肪酸合成的调节。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！40