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1、微生物工程重点内容微生物工程重点内容微生物工程发展简史微生物工程发展简史1、传统的微生物发酵技术、传统的微生物发酵技术天然发酵天然发酵2、第一代微生物发酵技术、第一代微生物发酵技术纯培养技术纯培养技术3、第二代微生物发酵技术、第二代微生物发酵技术深层培养技术深层培养技术4、第三代微生物发酵技术、第三代微生物发酵技术代谢调控技术代谢调控技术5、第四代发酵技术、第四代发酵技术基因工程技术基因工程技术次级代谢产物次级代谢产物secondary metabolite是指是指微生物微生物生长到一定阶段才产生的生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功
2、能，或功能，或并非是并非是微生物生长和繁殖所必需微生物生长和繁殖所必需的物质，如的物质，如抗生素抗生素、毒素毒素、激素激素、色素色素等。等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，他们可能积累在细胞内，也可能不相同，他们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。排到外环境中。2、微生物菌体的发酵、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳酸菌制剂、食用和药用酵母活性乳酸菌制剂、食用和药用酵母3、微生物的生物转化、微生物的生物转化 利用微生物细胞的一种或几种酶
3、，对外利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链还原双键、脱氧或切断支链等。等。转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物质经细胞代谢产生，而是微生物细胞的酶或酶系作质经细胞代谢产生，而是微生物细胞的酶或酶系作用于底物的某一部位，进行特定部位的化学反应而用于底物的某一部位，进行特定部位的化学反应而形成。形成。4）微生物特殊机能的利用）微生物特殊机能的利用 利用微生物消除环境污染利用微生物保持生态平衡 利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等（氧化硫杆菌、排硫杆菌、脱氨硫
4、杆菌、氧化亚铁硫杆菌（如芽孢杆菌属、土壤杆菌属）等。）利用基因工程菌生产动、植物细胞产品工业微生物的特点1、概念(什么是工业微生物)从来源于自然界大量的微生物中分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产的微生物称为工业微生物。通常在发酵过程作为活细胞催化剂 传统的工业微生物包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。目前最有应用前景的工业微生物：基因工程菌株2、工业微生物种类、工业微生物种类2.1原核细胞类微生物原核细胞类微生物:细菌、放线菌、立细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体等克次氏体、衣原体等2.2真核细胞类微生物真核细胞类微生物:酵母菌和霉菌，单酵母菌和霉菌，单细胞藻类、原生动物等细胞藻
5、类、原生动物等2.1非细胞类微生物（主要作为基因工程的非细胞类微生物（主要作为基因工程的载体）载体）:RNA病毒（逆转录病毒）病毒（逆转录病毒）DNA病病毒（腺病毒）毒（腺病毒）3、微生物的特点、微生物的特点3.1 种类多 3.2 分布广 3.3 体积小3.4 繁殖快 3.5 代谢强 3.6 易变异（1 1）廉廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。价原料、生长迅速、目的产物产量高。（2 2）易易于控制培养条件，生产效率于控制培养条件，生产效率高高。发酵周期较。发酵周期较短。短。（3 3）抗杂菌和噬菌体的能力）抗杂菌和噬菌体的能力强强。（4 4）菌种遗传性能）菌种遗传性能稳稳定，不易变异和退化，定
6、，不易变异和退化，不产生不产生任何有害的生物活性物质和毒素，任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。保证安全生产。（5 5）产品容）产品容易易分离提纯。对分离提纯。对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶；对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎。二、工业化菌种的要求二、工业化菌种的要求微生物与工业生产二、人类是如何利用微生物进行工业生产的呢？（通过微生物工业生产想获得什么？）1.获取菌体物质，例如蛋白、脂肪和糖类。2.获取微生物的代谢产物，例如抗生素、乙醇、甘油等等。3.利用微生物的酶作为活化剂进行产品加工。基因工程菌与传统工业微生物的
7、差别前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;前者需要发酵条件满足外源基因的表达，后者则只需要满足细菌本身的生长和代谢需要要获得高水平的产品，基因工程菌生产过程中往往使用高密度发酵基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。培养基的主要成分及作用培养基的主要成分及作用 一、碳源一、碳源主要功能：主要功能：1 1）为菌体的生长繁殖提供能源和合）为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所成菌体所 必需的成分；必需的成分；2 2）为合成目的产物提供所需的碳素）为合成目的产物提供所需的碳素成分成分常用的碳源常用的碳源:特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解物或氨特殊
8、情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。基酸等也可被微生物作为碳源使用。糖类糖类 发酵培养基中使用最广泛的碳源发酵培养基中使用最广泛的碳源;主要有葡萄糖、糖蜜主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等和淀粉糊精等油脂油脂 这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成化成CO2和和H2O，并释放出大量的能量。，并释放出大量的能量。当微生物利用脂肪作当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧，不然
9、大量的脂肪酸和代谢为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧，不然大量的脂肪酸和代谢中的有机酸会积累，从而引起中的有机酸会积累，从而引起pH的下降，并影响微生物酶系统的下降，并影响微生物酶系统的作用。的作用。常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等有机酸有机酸 一些微生物对多种有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）一些微生物对多种有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）有很强的氧化能力，可以有机酸或有机酸盐作为碳源。有很强的氧化能力，可以有机酸或有机酸盐作为碳源。有机有机酸的利用常会使酸的利用常会使pH上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱上升，尤其是有机酸盐氧化时
10、，常伴随着碱性物质的产生，使性物质的产生，使pH进一步上升。进一步上升。低碳醇等低碳醇等二、氮源二、氮源有机氮源有机氮源：豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、：豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等玉米浆、尿素等无机氮源：无机氮源：铵盐、硝酸盐等（由于细胞内的含氮物质都以氨基或铵盐、硝酸盐等（由于细胞内的含氮物质都以氨基或亚氨基的形式存在，故铵态氮可以直接用于合成细胞物质；而硝态亚氨基的形式存在，故铵态氮可以直接用于合成细胞物质；而硝态氮需还原成氨后才能被利用）氮需还原成氨后才能被利用）分类：无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为速效分类：无机氮源和尿素、玉米
11、浆等可被迅速利用，为速效氮；氮；蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，属迟效氮属迟效氮氮源物质常对培养液氮源物质常对培养液pH产生影响产生影响在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的的pH下降，为生理酸性物质；下降，为生理酸性物质；硝酸钠被同化时则引起培养液硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质上升，为生理碱性物质三、无机盐和微量元素三、无机盐和微量元素 磷酸盐：磷酸盐：磷是某些蛋白质和核酸的组成成分磷是某些蛋白质和核酸的组成成分磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用磷酸盐在培养
12、基中还具有缓冲作用微生物对磷的需要量一般为微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L常用常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4 钾盐：钾盐：钾不参与细胞结构物质的组成钾不参与细胞结构物质的组成是许多酶的是许多酶的激活剂激活剂菌体生长所需钾量约为菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以以K2SO4计计)微量元素微量元素：需量微少，但又不可缺少需量微少，但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加不必另加某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性毒性 硫酸镁：
13、Mg 2+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分硫是构成一些酶的活性基硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。四、生长因子四、生长因子概念：概念：微生物生长不可缺少的微量有机物质。微生物生长不可缺少的微量有机物质。类别：类别：维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍物维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍物提供生长因子的农副产品原料提供生长因子的农副产品原料1）玉米浆）玉米浆用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液
14、，也是玉米淀用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品粉生产的副产品虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。2）麸皮水解液：）麸皮水解液：可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。米浆少。用量一般为用量一般为1%（以干麸皮计）左右（以干麸皮计）左右3）糖蜜）糖蜜甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低含量较低甘蔗糖蜜
15、用量为甘蔗糖蜜用量为0.1%0.4%4)酵母酵母：酵母膏、酵母浸出液、酵母粉酵母膏、酵母浸出液、酵母粉5）其他：）其他：牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子的生长因子五、水五、水生理功能：1）是微生物机体的重要组成部分）是微生物机体的重要组成部分2）进行代谢反应的介质）进行代谢反应的介质3）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动；才能通过细胞表面进行正常的活动；4）水的比热高，能有效吸收代谢过程中放出）水的比热高，能有效吸收代谢过程中放出的热，使细胞内温度不致
16、骤然上升；同时水的热，使细胞内温度不致骤然上升；同时水又是热的良导体，有利于散热，可调节细胞又是热的良导体，有利于散热，可调节细胞温度。温度。1 1、培养基分类：、培养基分类：按培养基成分按培养基成分1 1）合成培养基：）合成培养基：所用原料的化学成分明确、稳定所用原料的化学成分明确、稳定如如葡萄糖、硫酸铵葡萄糖、硫酸铵适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作；在生产某些疫苗的过程中，为了防止异性蛋白质等科研工作；在生产某些疫苗的过程中，为了防止异性蛋白质等杂质掺入，也常用合成培养基；杂质掺入，也常用合成培养基；营养单一、价格较高，不适营养单一、价格
17、较高，不适于大规模生产于大规模生产2 2）天然培养基：）天然培养基：原料是一些天然动、植物产品原料是一些天然动、植物产品如花如花生饼粉、蛋白胨等生饼粉、蛋白胨等来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格低廉、适于工业化生产价格低廉、适于工业化生产一般不需要另加微量元素、维生素一般不需要另加微量元素、维生素等物质等物质由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性制会影响生产稳定性3.半合成（组合）培养基：半合成（组合）培养基：在合成培养基的基础上添加在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更
18、有效地满足微生物对营养物的需要些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要如马铃薯如马铃薯-蔗糖培养基蔗糖培养基3 3、根据培养基用途来分根据培养基用途来分基础培养基基础培养基富集培养基富集培养基选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基按生产工艺来分按生产工艺来分孢子培养基孢子培养基种子培养基种子培养基发酵培养基发酵培养基1）孢子培养基：）孢子培养基：供菌种繁殖孢子的培养基，常用固体培养基。供菌种繁殖孢子的培养基，常用固体培养基。孢子培养基基本要求：孢子培养基基本要求：基本要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢基本要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子，且不易引起菌种发生变异。子，且不易引
19、起菌种发生变异。配制时需注意配制时需注意A）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。B）所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色。C）注意pH和培养基的湿度。常用孢子培养基常用孢子培养基 麸皮培养基 小米培养基 大米培养基 玉米碎屑培养基 用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基 注意：注意：大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少、疏松、表面积大，是良好的孢子培养基。2）种子培养基：供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。）种子培养基：供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达较高
20、的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。种子培养基的成分要考虑在代谢过程中能维持稳定的pH，其成分还要根据不同菌种的主要特征而定。3）发酵培养基：）发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。要使种子接入后能迅速生长，达到一定的菌体浓度又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。基础培养基：基础培养基：是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养成分的培养基；养成分的培养基；加富培养基：加富培养基：在基本培养基中加入某些
21、特殊的营在基本培养基中加入某些特殊的营养物质，如血、血清、动植物组织液或其他营养物养物质，如血、血清、动植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。富集培养基：富集培养基：用来用来富集（使数量上占优势）富集（使数量上占优势）和分离某和分离某种特定微生物或用以培养营养要求苛刻的微生物种特定微生物或用以培养营养要求苛刻的微生物.选择培养基选择培养基：具体说，是具体说，是加入相应的特殊营养物质或加入相应的特殊营养物质或有抑菌性的化学物质有抑菌性的化学物质,以抑制不需要的微生物的生长以抑制不需要的微生物的生长,而而促进所需微生物的生长。促进所需
22、微生物的生长。用于将某种或某类微生物从混用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中杂的微生物群体中分离出来分离出来.鉴别培养基：鉴别培养基：用于鉴别不同类型微生物的培养基。用于鉴别不同类型微生物的培养基。在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂指示剂或化学药品或化学药品，从而产生某种明显的，从而产生某种明显的特征性变化特征性变化，以区别，以区别不同的微生物以便于根据目的选择性挑取或计数等。不同的微生物以便于根据目的选择性挑取或计数等。小结小结培养基的类型培养基的类型分类依据分类依据类型类型营养物质来源营养物质来源天然、合成、半合成天然、合成
23、、半合成培养基物理状态培养基物理状态液体、固体、半液体液体、固体、半液体培养基的成分和目的培养基的成分和目的基本、完全、鉴别、选择基本、完全、鉴别、选择生产工艺的要求生产工艺的要求孢子孢子(Spore)、种子、发酵、种子、发酵培养基的用途：培养基的用途：筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产等发酵生产等巴斯德效应巴斯德效应Pasteureffect 1861年巴斯德年巴斯德(L.Pasteur)在研究酵母的酒精发酵量和氧分在研究酵母的酒精发酵量和氧分压之间的关系中发现压之间的关系中发现在厌氧在厌氧条件下条件下,向高速发酵的向高速发酵的培养基中通
24、入氧气培养基中通入氧气,则则葡萄糖消耗减少葡萄糖消耗减少,抑制抑制发酵产物积累的现象发酵产物积累的现象称为巴斯德效应。即称为巴斯德效应。即呼吸抑制发酵的作用。呼吸抑制发酵的作用。在好氧条件下，在好氧条件下，酵母发酵能力下降。酵母发酵能力下降。1.磷酸果糖激酶，是变构酶，受磷酸果糖激酶，是变构酶，受ATP，柠檬，柠檬酸及其他高能化合物抑制，被酸及其他高能化合物抑制，被AMP,ADP激激活；在好气条件下，糖代谢进入活；在好气条件下，糖代谢进入TCA，产，产生柠檬酸并通过氧化磷酸化生成大生柠檬酸并通过氧化磷酸化生成大ATP，细胞内柠檬酸生成增加，反馈抑制磷酸果细胞内柠檬酸生成增加，反馈抑制磷酸果糖激
25、酶的合成，阻遏作用由于糖激酶的合成，阻遏作用由于ATP反馈抑反馈抑制此酶的活性而加强；制此酶的活性而加强；2.由于磷酸果糖激酶受抑制，导致由于磷酸果糖激酶受抑制，导致6-磷酸果磷酸果糖积累，当反应糖积累，当反应6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 6-磷酸果糖磷酸果糖达到平衡，醛糖和酮糖的摩尔比达到平衡，醛糖和酮糖的摩尔比=7:3，导，导致致6-磷酸葡萄糖积累，反馈抑制己糖激酶，磷酸葡萄糖积累，反馈抑制己糖激酶，抑制葡萄糖进入细胞内，导致葡萄糖利用抑制葡萄糖进入细胞内，导致葡萄糖利用率降低；率降低；3.好气条件下丙酮酸激酶的活性降低，此酶好气条件下丙酮酸激酶的活性降低，此酶受磷酸果糖激酶催化生成的受磷酸果
26、糖激酶催化生成的1,6-二磷酸果糖二磷酸果糖的激活，丙酮酸激酶活性降低，导致磷酸的激活，丙酮酸激酶活性降低，导致磷酸烯醇丙酮酸积累，反馈抑制己糖激酶；烯醇丙酮酸积累，反馈抑制己糖激酶；在厌氧发酵过程中，丙酮酸在不同的受氢体的在厌氧发酵过程中，丙酮酸在不同的受氢体的作用下产物会不同，也就是说在不同酶的催作用下产物会不同，也就是说在不同酶的催化下会获得不同的产物，都有哪些酶和哪些化下会获得不同的产物，都有哪些酶和哪些产物？产物？乳酸脱氢酶-乳酸丙酮酸脱羧酶-乙醛-乙醇脱氢酶-乙醇丙酮酸脱氢酶-乙酰CoA-丁酰 CoA丁醛-丁醇丙酮什么是好氧发酵和厌氧发酵，其主要代表产品什么是好氧发酵和厌氧发酵，其
27、主要代表产品有哪些有哪些好氧发酵：好氧发酵：发酵时需要氧的参与，而且在氧气充足的条件下发酵效率更高 代表产品：链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素厌氧发酵：厌氧发酵：发酵时不需要氧的参与，氧气可能会对发酵产生不良影响 代表产品：酒精、丙酮、丁醇、甘油A.A.亚硫酸盐法甘油发酵（酵母第二型发酵）亚硫酸盐法甘油发酵（酵母第二型发酵）C6H12O6+NaSHO32CH2OHCHOHCH2OH+CH3CHOHOSO2Na+CO2在酵母中，乙醇脱氢酶活力很强，在该酶的作用下，乙醛作为受氢体而被还原成乙醇，因此，在乙醇发酵中，甘油生成量很少。如果改变发酵条件或者加入某种抑制剂，阻止乙醛作为受氢体，就可以
28、积累大量甘油，如在发酵醪中加入亚硫酸氢亚硫酸氢钠，与乙醛起加成反应生成难钠，与乙醛起加成反应生成难溶的乙醛亚硫酸氢钠加成物。溶的乙醛亚硫酸氢钠加成物。这样乙醛不能作为受氢体，必须有磷酸二磷酸二羟丙酮羟丙酮作为受氢体，生成大量甘油，即转为甘油发酵，也叫做酵母第二型发酵。B.B.碱法甘油发酵碱法甘油发酵(酵母第三型发酵酵母第三型发酵)2C6H12O6+H2O2CH2OHCHOHCH2OH+C2H5OH+CH3COOH+2CO2当酵母在碱性（碱性（PH7.6）条件）条件下进行发酵，所生成的乙醛也不能作为受氢体，两个乙醛分子起歧两个乙醛分子起歧化作用，相互氧化还原，生成等化作用，相互氧化还原，生成等量
29、的乙醇和乙酸，量的乙醇和乙酸，这时，硫酸二硫酸二羟丙酮又成为羟丙酮又成为NADH+H+的受氢的受氢体，体，总的产物为甘油，乙酸，乙甘油，乙酸，乙醇，和醇，和CO2.总反应式为总反应式为:C6H12O6+2ADP+2H3PO42CH3CHOHCOOH+2ATP+135.56KJ理论转化率理论转化率:290/180100%=100%乳酸链球菌、酪乳杆菌、乳酸链球菌、酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌同型乳酸发酵是指发酵终同型乳酸发酵是指发酵终产物中产物中90以上为乳酸的乳酸以上为乳酸的乳酸发酵过程。发酵过程。同型乳酸发酵同型乳酸发酵(Homofermentation o
30、f lactic acid patheay)糖酵解途径（糖酵解途径（EMP）丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶异型乳酸发酵异型乳酸发酵Heterofermentationoflacticacidpatheay 总反应式为总反应式为:C6H12O6CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH理论转化率理论转化率:90/180100%=50%磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP)肠膜明串珠菌、葡聚糖明串珠菌肠膜明串珠菌、葡聚糖明串珠菌是指发酵终产物中除乳酸是指发酵终产物中除乳酸外，还有乙醇、乙酸和二氧化外，还有乙醇、乙酸和二氧化碳等成分的乳酸发酵过程。碳等成分的乳酸发酵过程。磷酸解酮酶磷酸解酮酶双歧途径双歧途径B
31、ifidumpatheay 总反应式为总反应式为:2C6H12O62CH3CHOHCOOH+3CH3COOH理论转化率理论转化率:(290)/(2180)100%=50%磷酸解酮酶途径磷酸解酮酶途径（HK）6-磷酸果糖酮解酶磷酸果糖酮解酶5-磷酸木酮糖磷酸酮解酶磷酸木酮糖磷酸酮解酶柠檬酸生物合成途径柠檬酸生物合成途径丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶第一个调节酶是磷酸果糖激酶（第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFKPFK）柠檬酸和柠檬酸和ATPATP对该酶有抑制对该酶有抑制 生产菌需要解除该抑制作用AMPAMP、无机磷以及、无机磷以及NHNH4 4+对该酶有活
32、对该酶有活化作用化作用NHNH4 4+有效解除柠檬酸和有效解除柠檬酸和ATPATP对该酶的对该酶的抑制，抑制，NH4+浓度与柠檬酸生产速度浓度与柠檬酸生产速度有密切关系，正是细胞内有密切关系，正是细胞内NH4+浓度浓度升高，使升高，使PFK对细胞内积累的大量对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。柠檬酸不敏感。故生产上通过添加故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量铵盐来提高柠檬酸产量磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节糖酵解及丙酮酸代谢的调节Mn2+的影响：的影响：Mn2+缺乏缺乏HMP和和TCA循环酶水平低，生长期菌丝体的蛋白质、循环酶水平低，生长期菌丝体的蛋白质、核酸和脂肪含量明显减
33、少，氨基酸和核酸和脂肪含量明显减少，氨基酸和NH4+水平升高水平升高Mn2+缺乏缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NHNH4 4+水平升高水平升高减少柠檬酸对减少柠檬酸对PFK的抑制的抑制Mn2+缺乏缺乏高糖高糖NHNH4 4+GluGlnOrnArg氨基丁酸蛋白质和蛋白质和RNA转换过程中细转换过程中细胞蛋白的再合胞蛋白的再合成受损伤成受损伤1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节糖酵解及丙酮酸代谢的调节丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶的平衡丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶的平衡1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节糖酵解及丙酮酸代谢的调节丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶
34、柠檬酸合成酶是柠檬酸合成酶是TCATCA循环第一个酶。循环第一个酶。但黑曲霉中但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。柠檬酸合成酶没有调节作用。大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键。大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键。丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力。的提供，增加了柠檬酸的合成能力。2.三羧酸循环的调节三羧酸循环的调节柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸-顺乌头酸正
35、逆顺乌头酸正逆反应的酶，作用需要反应的酶，作用需要FeFe2+2+。（1 1）添加）添加Fe2+络合物络合物（2 2）筛选该酶缺失或活力降低的菌株）筛选该酶缺失或活力降低的菌株（3 3）随着柠檬酸的积累，高酸环境可进一步造成）随着柠檬酸的积累，高酸环境可进一步造成顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活2.三羧酸循环的调节三羧酸循环的调节顺乌头酸水合酶顺乌头酸水合酶2.三羧酸循环的调节三羧酸循环的调节NAD和和NADP-异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶黑曲霉中只有一种黑曲霉中只有一种NAD-NAD-异柠檬酸脱氢酶，且活力异柠檬酸脱氢酶，且活力很低。很低。NADP-NAD
36、P-异柠檬酸脱氢酶有两种：异柠檬酸脱氢酶有两种：（1 1）细胞质中的不受柠檬酸抑制）细胞质中的不受柠檬酸抑制（2 2）线粒体中受生理浓度柠檬酸抑制。）线粒体中受生理浓度柠檬酸抑制。一旦柠檬酸积累到一定水平，就能抑制其自身的进一步一旦柠檬酸积累到一定水平，就能抑制其自身的进一步分解，从而促进自身的积累分解，从而促进自身的积累2.三羧酸循环的调节三羧酸循环的调节-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCATCA循环的一个显著特点是，循环的一个显著特点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和NH4+的阻遏。因此的阻遏。因此当以葡萄糖
37、为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。酮戊二酸脱氢酶或活力很低。-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCATCA循环中唯一不可逆反循环中唯一不可逆反应，一旦应，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：TCATCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCATCA循环生成，使循环生成，使TCATCA循环成循环成“马蹄形马蹄形”。-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。乙酰乙酰CoACoA和草酰乙
38、酸结合生成柠檬酸过程和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：用为：(1)(1)氧是发酵过程生成的氧是发酵过程生成的NADHNADH2 2重新氧化的氢受体。重新氧化的氢受体。(2)(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。2.三羧酸循环的调节三羧酸循环的调节-氧对柠檬酸积累的调节氧对柠檬酸积累的调节当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系当
39、缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。2.三羧酸循环的调节三羧酸循环的调节氧对柠檬酸积累的调节氧对柠檬酸积累的调节柠檬酸的积累机制小结：柠檬酸的积累机制小结：MnMn2+2+缺乏缺乏抑制蛋白合成抑制蛋白合成NH4NH4+，形成一条呼，形成一条呼吸活动强的不产生吸活动强的不产生ATPATP的侧呼吸链，的侧呼吸链，解除磷酸果糖解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进激酶的代谢调节，促进EMPEMP途径畅通。途径畅通。丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，草酰丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，草酰乙酸合成有
40、保证。乙酸合成有保证。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoACoA和和COCO2 2的固定两个反的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。成柠檬酸的能力。柠檬酸的积累机制小结：柠檬酸的积累机制小结：顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90=90：3 3：7 7，同，同时控制时控制FeFe2+2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。使柠檬酸积累。随着柠檬酸积累，随着柠檬酸积累，pHpH
41、降低到一定程度时，降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。利于柠檬酸的积累。柠檬酸的积累机制小结：柠檬酸的积累机制小结：-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和NHNH4 4+的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮酮戊二酸脱氢酶或活力很低。戊二酸脱氢酶或活力很低。-酮戊二酸抑制异柠檬酸脱氢酶的活酮戊二酸抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，促使柠檬酸的积累性，促使柠檬酸的积累柠檬酸发酵过程的控制要点柠檬酸发酵过程的控制要点（1
42、1）控制）控制MnMn2+2+、NHNH4 4+浓度，解除柠檬酸对浓度，解除柠檬酸对PFKPFK的抑制，使的抑制，使EMPEMP畅通无阻。畅通无阻。（3 3）控制培养基中的）控制培养基中的FeFe2+2+的浓度，使顺的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。乌头酸水合酶失活。（2 2）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。氨基酸发酵的代谢调控氨基酸发酵的代谢调控1控制旁路代谢控制旁路代谢2降低反馈作用物的浓度降低反馈作用物的浓度3消除终产物的反馈抑制与阻遏消除终产物的反馈抑制与阻遏4控制细胞渗透性控制细胞渗透性5控制发酵的环境控制发酵的环境6促进促进ATP的积累以利氨基酸的生物合成的
43、积累以利氨基酸的生物合成一、谷氨酸生物合成途径及调节机制一、谷氨酸生物合成途径及调节机制3mol醋酸醋酸：1mol柠檬柠檬酸酸生成的柠檬酸一半转化生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸为异柠檬酸酵母酵母N源耗尽后开始烷源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度烃发酵，低浓度AMP抑抑制制NAD-异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸顺乌头酸=90：7：3。细胞质中积累大量异柠细胞质中积累大量异柠檬酸。檬酸。谷氨酸生产菌中存在谷氨酸生产菌中存在2 2个糖酵解
44、途径个糖酵解途径EMP/HMPEMP/HMP生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度速度丙酮酸积累丙酮酸积累亚砷酸抑制亚砷酸抑制EMP途径：途径：HMP途径途径90：10生物素生物素HMP38%HMP26%黄色短杆菌黄色短杆菌产氨短杆菌产氨短杆菌TCA循环柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶乌头酸酶乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶拮抗拮抗氟乙酸氟乙酸氟乙酸抗性株氟乙酸抗性株谷氨酸产量升高谷氨酸产量升高氟乙酸是乌头酸酶的专一抑制剂氟乙酸是乌头酸酶的专一抑制剂酮酮戊二酸脱戊二酸脱氢氢酶酶活力低活力低酮酮戊二酸戊二酸积积累累NH4+谷氨酸脱谷氨酸脱氢氢酶酶谷氨酸谷氨酸-酮戊二
45、酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶ATP3C6H12O66C3H4O36CH3COOH6CO26CH3COOH+2NH3+3O22C5H9O4N+2CO2+6H2O以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是在谷以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是在谷氨酸生成期氨酸生成期DCA循环应关闭循环应关闭异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶TCA循环的中间产物循环的中间产物异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶抑制抑制黄色短杆菌黄色短杆菌Km0.01mmol/LKm0.8mmol/L有机酸浓度低时有机酸浓度低时DCA循环循环有机酸浓度高时有机酸浓度高时TCA循环循环在谷氨酸发酵中，在谷氨酸发酵中，DCADCA环
46、一方面可以作为环一方面可以作为TCATCA循环有缺陷时循环有缺陷时C4C4二羧酸的补充二羧酸的补充 在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量作用DCADCA循环循环异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶CO2固定固定在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶 谷氨酸对糖的转化率达到81.7%PEP乙酰乙酰CoA草酰乙酸、草酰乙酸、PEP羧化酶羧化酶丙酮酸激酶丙酮酸激酶PEP浓度低时浓度低时乙酰乙酰CoA与二磷酸果糖不能激活与二磷酸果糖不能激活PEP羧化酶羧化酶分解分解乙酰乙酰CoA浓度增加，与二磷酸果糖共同激活浓度增加，与二磷酸果糖共同激活PEP羧
47、化酶，羧化酶，CO2固定固定增加增加TCA循环中间产物浓度循环中间产物浓度天冬氨酸天冬氨酸反馈抑制反馈抑制PEP羧化酶羧化酶分解分解防止草酰乙酸防止草酰乙酸当乙酰当乙酰CoA氧化氧化ATP丙酮酸激酶抑制丙酮酸激酶抑制CO2固定固定氨的导入氨的导入合成谷氨酸的反应有合成谷氨酸的反应有3 3种：种：+-酮戊二酸酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶谷氨酸转氨酶-酮戊二酸酮戊二酸+-酮戊二酸酮戊二酸+谷氨酰胺谷氨酰胺NADPHNADPH+2谷氨酸谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶谷氨酸合成酶-酮戊二酸酮戊二酸+NH4+NADPH谷氨酸谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶生产菌中生
48、产菌中谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶酸的主要酶谷氨酸转氨酶活力低，转氨谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑作用可以不考虑谷氨酸合成酶由于不受高浓谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得度谷氨酸抑制，其作用值得重视重视谷氨酸谷氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸天冬氨酸或丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸+谷氨酸谷氨酸-酮戊二酸+为何谷氨酸合成酶在合成谷氨酸过程中值得重视？为何谷氨酸合成酶在合成谷氨酸过程中值得重视？谷氨酸合成酶的谷氨酸合成酶的KmNH4+只有谷氨酸脱氢酶的只有谷氨酸脱氢酶的1/10，当环境中，当环境中NH4+浓度很低时，由该途径合成谷氨酸。
49、浓度很低时，由该途径合成谷氨酸。当细胞内谷氨酸浓度高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑当细胞内谷氨酸浓度高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶。制谷氨酸合成酶。异柠檬酸脱氢酶（异柠檬酸脱氢酶（NADP）与谷氨酸脱氢酶）与谷氨酸脱氢酶（NADPH+H+）形成共轭体系，）形成共轭体系，在活细胞中异柠檬酸脱氢酶活性总比谷氨酸脱氢酶在活细胞中异柠檬酸脱氢酶活性总比谷氨酸脱氢酶低低谷氨酸谷氨酸为何说为何说NADPNADP浓度是限速因子，决定谷氨酸的产量？浓度是限速因子，决定谷氨酸的产量？生物素和生物素和NH4NH4+对谷氨酸发酵如何影响？对谷氨酸发酵如何影响？生物素缺乏，生物素缺乏，NH
50、 NH4 4+提高糖代谢提高糖代谢速度速度高效合成谷氨酸高效合成谷氨酸生物素充足时，生物素充足时，NH NH4 4+不影响糖代谢速度不影响糖代谢速度细胞膜通透性控制细胞膜通透性控制结论：谷氨酸分泌是由细胞膜控制的。结论：谷氨酸分泌是由细胞膜控制的。结论：细胞膜的谷氨酸通透性受细胞膜的结论：细胞膜的谷氨酸通透性受细胞膜的磷脂含量控制磷脂含量控制菌种选育模型菌种选育模型细胞膜通透性细胞膜通透性细胞膜磷脂含量细胞膜磷脂含量磷脂磷脂不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸 甘油甘油磷酸磷酸侧链侧链控制油酸合成控制油酸合成控制甘油合成控制甘油合成控制磷脂合成控制磷脂合成生物素缺陷型生物素缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成阻断