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1、细菌鉴定中常用的生细菌鉴定中常用的生理生化反应理生化反应实验目的和内容na.了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；nb.通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；nc.了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；实验原理n细菌生化试验n各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。实验原理细菌生化试验n糖(醇)类发酵试验n 不同的细菌含
2、有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫pH52(黄色)一68(紫色)，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。实验原理细菌生化试验n甲基红(Methylred)试验(该试验简称MR试验)n很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到42以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH44(红色)pH62(黄色)。若某些细菌如产气杆菌，分
3、解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基的pH仍在62以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。实验原理大分子物质代谢实验 n靛基质(吲哚)试验n某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。n硫化氢试验n某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。实验原理大分子物质代谢实验 n明胶液化实验n某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。n淀粉水解试验（在紫
4、外诱变中做，本实验不做）n细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。实验原理有机酸盐及氨盐利用试验n柠檬酸盐利用试验n柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。实验仪
5、器,材料和用具n实验仪器n37恒温培养箱、20恒温培养箱（室温代替）。n微生物材料n大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1支。n试剂n甲基红试剂、VP试剂、吲哚试剂、格里斯试剂(硝酸盐利用试验)、卢戈氏碘液(淀粉水解试验)实验仪器,材料和用具n实验用具n试管：每份每个试验2根试验，1根对照，8个试验共27根。n无菌乎皿：每份2个n杜氏小管：每份6个。n接种环、酒精灯、试管架、记号笔。实验仪器,材料和用具n培养基n葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基：每份各6支试管，每支510mi培养基，灭菌。用于糖类发酵试验。n葡萄糖蛋白胨水培养基：每份3支试管，每支510mi培养基，灭菌。用
6、于甲基红和VP试验。n胰蛋白水培养基：每份3支每支510mi培养基，灭菌。用于吲哚试验。n柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基；每份3支，每支510ml培养基，灭菌。用于硫化氢试验。n营养明胶培养基：每份3支，每支510ml培养基、灭菌。用于明胶液化试验。n淀粉培养基：每份2个平皿，每平皿约20ml培养基，灭菌后倒入平皿。用于淀粉水解试验。n柠檬酸钠培养基：每份3支，每支5一lOml培养基，灭菌，做斜面。用于柠檬酸盐利用试验。实验步骤n糖(醇)类发酵试验n编号 在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。n接种 取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌
7、，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。n将已接种好的培养基置37温箱中培养24h。n观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色)，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体。气体占整个倒置小玻管的10以上。若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。实验步骤n甲基红试验(MR试验)n 将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37培养 48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者
8、为阳性，呈现黄色者为阴性。n伏一普二氏试验(VP试验)n 将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37培养48h，取出，加入40KOH 510滴，然后再加入等量的5一萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保温1530min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏普反应阳性。实验步骤n靛基质(吲哚)试验n 将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，37培养24h48h后，沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。n 出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。实验步骤n硫化氢试验：n将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37培养24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。实验步骤n明胶
9、液化试验n 取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置20培养57天。观察明胶培养基液化情况。若被检细菌20不易生长，可放37培养，但在此温度下明胶培养基呈液状，故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4冰箱30min，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。实验步骤n淀粉水解试验n将配制好的淀粉培养基冷却到50左右，以无菌操作制成平板。n用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置37温箱培养24h。n将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。实验步骤n柠檬酸盐利用试验n取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，37培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。培养基不变色，则继续培养7天，培养基仍不变色者为阴性。实验结果糖发酵实验结果与讨论n记录上述各试验结果；n在吲哚试验和硫化氢试验中细菌各分解何种氨基酸?谢谢大家！