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1、上海交通大学医学院分上海交通大学医学院分子生物学课程子生物学课程DNA1DNA1BREAKTHROUGH OF THE YEAR 2007:Human Genetic Variation 21 DECEMBER 2007 SCIENCE一、核酸研究简史一、核酸研究简史 第一阶段：核酸的发现第一阶段：核酸的发现第二阶段：发现核酸是遗传物质第二阶段：发现核酸是遗传物质第三阶段：为分子生物学奠定基第三阶段：为分子生物学奠定基础的时期础的时期第四阶段：分子生物学高速发展时期第四阶段：分子生物学高速发展时期第一节 DNA的结构与功能18891889年年 R.Altman R.Altman 从动物细胞与酵
2、母从动物细胞与酵母 菌中制备了菌中制备了核酸核酸18691869年年 F.Miescher F.Miescher 从脓细胞中得到从脓细胞中得到 核质核质“Nuclein”“Nuclein”第一阶段：核酸的发现第一阶段：核酸的发现18941894年年 A.Kossel A.Kossel 和和A.Neumann A.Neumann 从胸腺从胸腺 中提取核酸中提取核酸19301930年年 正式提出核酸分为两大类：正式提出核酸分为两大类：核糖核酸核糖核酸（RNARNA）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNADNA）19041904年年 Hammars Hammars 证明核酸中的糖是戊糖证明核酸中的糖是戊糖
3、.19091909年年 Levene Levene和和JacobsJacobs鉴定核酸中的糖鉴定核酸中的糖 是是D-D-核糖核糖.19121912年年 Levene Levene 认为核酸由认为核酸由4 4种核苷酸种核苷酸 组成组成19291929年年 Levene Levene 和和Jacobs Jacobs 确定胸腺核苷酸确定胸腺核苷酸 中的糖是中的糖是2-2-脱氧脱氧-D-D-核糖核糖 第二阶段：发现核酸是遗传物质第二阶段：发现核酸是遗传物质 19441944年年 AveryAvery等揭示了等揭示了DNADNA是细菌的遗传物质是细菌的遗传物质有荚膜的光滑型肺炎球菌（有荚膜的光滑型肺炎球
4、菌（S型）型）致病致病无荚膜的粗糙型肺炎球菌（无荚膜的粗糙型肺炎球菌（R型）型）不致病不致病 R R型菌型菌 R R型菌型菌 R R型菌型菌 +S S型菌型菌DNA DNA S S型菌型菌DNA DNA S S型菌型菌DNADNA （经蛋白酶水解）经蛋白酶水解）（经核酸酶水解）（经核酸酶水解）部分克隆变为部分克隆变为 部分克隆变为部分克隆变为 不能变为不能变为 S S型菌型菌 S S型菌型菌 S S型菌型菌19521952年年 Hershey HersheyChase Chase 通过噬菌通过噬菌体感染细菌的实体感染细菌的实验表明验表明病毒的遗病毒的遗传物质是传物质是DNADNA。1953年年
5、J.D.Watson和和F.Crick建立建立了了DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型第三阶段：为分子生物学奠定基础的时期第三阶段：为分子生物学奠定基础的时期1958年年*Kornberg*Kornberg等发现了等发现了DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA polymerase)(DNA polymerase)*Meselson等提出半保留复制，等提出半保留复制，阐明阐明DNA复制的机理复制的机理*Crick提出了遗传信息传递的提出了遗传信息传递的中心法则中心法则1965年年中国科学家人工合成牛胰岛素中国科学家人工合成牛胰岛素1970年年Temin等发现了从等发现了从RNADNA反转录现象，反转
6、录现象，使中心法则更完善使中心法则更完善1961年以后年以后Jacob、Nirenberg和和Monod等取得三个等取得三个有意义的进展：有意义的进展：1)证实了证实了mRNA携带着携带着DNA到蛋白质合成机制所到蛋白质合成机制所需要的信息需要的信息2)发现了遗传密码发现了遗传密码3)发现了蛋白质依靠发现了蛋白质依靠tRNA和核糖体的帮助翻译和核糖体的帮助翻译遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则（centraldogma）DNAmRNA转录转录多肽链多肽链翻译翻译蛋白质蛋白质翻译后加工翻译后加工DNA复制复制逆转录逆转录逆转录逆转录RNARNA复制复制复制复制第四阶段：分子生物学高速发
7、展时期第四阶段：分子生物学高速发展时期1.19711.1971年年 限制性内切酶发现，限制性内切酶发现，DNADNA的的 分离成为可能分离成为可能2.2.直读核苷酸序列方法直读核苷酸序列方法 (1975 (1975年年SangerSanger发明发明)3.DNA3.DNA体外重组技术体外重组技术 (1972 (1972年年 Berg Berg发明发明)19821982年年 中国科学家人工合成酵母中国科学家人工合成酵母 丙氨酸丙氨酸tRNAtRNA19851985年年 Mullis Mullis建立建立PCRPCR技术技术19811981年年 T.Cech T.Cech发现四膜虫发现四膜虫rRN
8、ArRNA前体的前体的 自我拼接自我拼接,称为称为ribozyme.ribozyme.人类科学史上的三大工程人类科学史上的三大工程 人类基因组计划人类基因组计划曼哈顿原子计划曼哈顿原子计划阿波罗登月计划阿波罗登月计划 19901990年年 美国正式启动人类基因组计划。美国正式启动人类基因组计划。(human genome project,HGP)(human genome project,HGP)19991999年年7 7月月 我国得到完成人类我国得到完成人类3号染色体号染色体短臂上一个约短臂上一个约30Mb区域的测区域的测序任务，该区域约占人类整个序任务，该区域约占人类整个基因组的基因组的1
9、%，简称，简称1%项目。项目。提前两年于提前两年于2001年年8月月26日日,绘绘制完成制完成“中国卷中国卷”，赢得了国际，赢得了国际科学界的赞誉。科学界的赞誉。2003年年4月月美、英、日、法、德、中等国政府首脑联美、英、日、法、德、中等国政府首脑联名发表六国政府首脑关于完成人类基因名发表六国政府首脑关于完成人类基因组序列图的联合声明。组序列图的联合声明。19971997年年 英国爱丁堡罗斯林研究所首次英国爱丁堡罗斯林研究所首次 育成克隆羊。育成克隆羊。水稻基因组（水稻基因组（Rice Genome）2001年年10月，月，中科院、科技部和国家计委联中科院、科技部和国家计委联合向全世界宣布，
10、中国率先完合向全世界宣布，中国率先完成水稻（籼稻）基因组工作成水稻（籼稻）基因组工作“框架图框架图”的绘制的绘制2002年年4月月5日，日，在在Science 杂志上以封面文章杂志上以封面文章的形式发表。的形式发表。*后基因组计划（后基因组计划（post-genome projectpost-genome project）又称为功能基因组学又称为功能基因组学 （functional genomicsfunctional genomics）*蛋白质组（蛋白质组（proteomeproteome）计划）计划 又称为蛋白质组学（又称为蛋白质组学（proteomicsproteomics）*随着许多新
11、的随着许多新的RNARNA功能陆续被发现，功能陆续被发现，20002000年各国科学家提出了年各国科学家提出了RNARNA组的研究，组的研究，称为称为RNARNA组学（组学（RNomicsRNomics）*生物信息学生物信息学(bioinformatics)*系统生物学系统生物学(systemsbiology)二、二、DNADNA研究的临床应用研究的临床应用 1.1.疾病发病机理的研究疾病发病机理的研究 1 1）遗传性疾病遗传性疾病 基因变异或基因缺陷是疾病发生的根基因变异或基因缺陷是疾病发生的根 本原因本原因如如:镰刀状红细胞性贫血镰刀状红细胞性贫血的致病因素是由的致病因素是由 于珠蛋白第于
12、珠蛋白第6 6位氨基酸由谷氨酸突变为位氨基酸由谷氨酸突变为 缬氨酸。缬氨酸。如：如：心血管疾病心血管疾病 型高脂蛋白血症的形成主要是由于型高脂蛋白血症的形成主要是由于ApoEApoE基因中第基因中第112112位和第位和第158158位的位的G G和和C C发生变异，蛋白质肽链上原来发生变异，蛋白质肽链上原来 Arg Arg 变成变成CysCys，失去与失去与ApoEApoE受体结合的能力，使受体结合的能力，使血脂升高血脂升高 2 2）肿瘤肿瘤癌基因激活和抑癌基因失活癌基因激活和抑癌基因失活分化受阻分化受阻肿瘤细胞（永生型）肿瘤细胞（永生型）如：上世纪如：上世纪7070年代发现了癌基因年代发现
13、了癌基因（H-rasH-ras)与抑癌基因与抑癌基因(RbRb)。2.2.疾病的基因诊断疾病的基因诊断 DNA DNA诊断：诊断：*快速快速DNADNA点杂交点杂交 *限制性内切酶酶谱分析法限制性内切酶酶谱分析法 *DNA *DNA限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 分析法分析法 （RFLPRFLP）*聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）产前诊断、植床前诊断产前诊断、植床前诊断 A BKb 1 2 3 1 2 3 Kb8.3hcs-L 6.7hcs-B5.8hcs-A3.8hGH-N3.0hGH-V1.2hHG-V25.021.817.914.8单纯性生长激素缺乏症单纯性生长激素缺
14、乏症(IGHD)(IGHD)(isolatedgrowthhormonedeficience)图中图中 A A为为BamHIBamHI酶解片段与酶解片段与hGH cDNAhGH cDNA探针杂交放射自显影图探针杂交放射自显影图 B B为为HindIHindI酶解片段与酶解片段与hGHcDNhGHcDNA A探针杂交放射自显影图探针杂交放射自显影图 1 1 为正常人为正常人.2.2 为为IGHDIGHD患者患者.3 .3 为杂合子为杂合子DNADNA hcs hcs 为人绒毛膜促乳素为人绒毛膜促乳素.h.hGH GH 为人生长激素为人生长激素父亲父亲母亲母亲孩子孩子GTCGTACGTGACACA
15、CACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACAGTACGATACGT父亲父亲母亲母亲孩子孩子46bp42bp40bp42bp42bp46bp40bp42bp40bpPCR结果的凝胶电泳：结果的凝胶电
16、泳：图：某个图：某个CA2核苷酸重复的微卫星在一个家系中的核苷酸重复的微卫星在一个家系中的PCR检测结果示意图检测结果示意图短串联重复短串联重复(short tandem repeat,STR)多态性分析多态性分析 3.3.疾病的预防与基因治疗疾病的预防与基因治疗 1 1）采用基因工程产生疫苗药物）采用基因工程产生疫苗药物 2 2）基因治疗）基因治疗世界首例癌症疫苗世界首例癌症疫苗由美国由美国Merck公司研制，专门针对人乳头状瘤病毒（公司研制，专门针对人乳头状瘤病毒（HPV）的疫苗的疫苗“加德西加德西”（Gardasil），），2006年年6月月8日获得美国日获得美国FDA的上市批准。这是世
17、界上第一个，也是惟一一个获准上市的上市批准。这是世界上第一个，也是惟一一个获准上市的用来预防由的用来预防由HPV6、11、16和和18型引起的宫颈癌和生殖器型引起的宫颈癌和生殖器官癌前病变的癌症疫苗，保护率超过官癌前病变的癌症疫苗，保护率超过95%。该癌症疫苗的推出，将是人类首次真正尝试通过疫苗将一种该癌症疫苗的推出，将是人类首次真正尝试通过疫苗将一种癌症彻底消除。癌症彻底消除。德国科学家拉尔德楚尔豪森 2008年诺贝尔生理学或医学奖 构件分子构件分子核苷酸核苷酸nucleotidenucleotide核苷核苷nucleosidenucleoside 磷酸磷酸phosphatephosphat
18、e 碱基碱基bases bases 戊糖戊糖pentosepentose 嘧啶嘧啶pyrimidinepyrimidine 嘌呤嘌呤purinepurine 核糖核糖riboseribose 脱氧核糖脱氧核糖deoxyribose deoxyribose 三、核酸三、核酸的结构的结构核酸核酸（多核苷酸（多核苷酸PolynucleotidePolynucleotide)（一）分子组成（一）分子组成1.1.1.1.含氮有机碱含氮有机碱含氮有机碱含氮有机碱 （1 1 1 1）嘧啶碱：胞嘧啶）嘧啶碱：胞嘧啶）嘧啶碱：胞嘧啶）嘧啶碱：胞嘧啶C C C Cytosineytosineytosineytos
19、ine 胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶T T T Thyminehyminehyminehymine 尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶U U U Uracil racil racil racil（2 2 2 2）嘌呤碱：腺嘌呤）嘌呤碱：腺嘌呤）嘌呤碱：腺嘌呤）嘌呤碱：腺嘌呤A A A Adeninedeninedeninedenine 鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤G G G Guanine uanine uanine uanine 碱基上有修饰：碱基上有修饰：核苷的大写字母前加上代表修饰基团核苷的大写字母前加上代表修饰基团的小写字母右上方写明碱基的第几位的小写字母右上方写明碱基的第几位m2G表示表示2-
20、N-甲基鸟苷甲基鸟苷 位置位置 m3227G表示表示N2，N2，7-三甲鸟苷三甲鸟苷 数量数量 S4U表示表示4-硫代尿嘧啶硫代尿嘧啶甲基甲基(3)稀有碱基稀有碱基R苷苷2.戊糖戊糖顺式腺苷顺式腺苷反式腺苷反式腺苷3.3.核苷核苷：C-N C-N 糖苷键糖苷键嘌呤碱嘌呤碱N9嘧啶碱嘧啶碱N1戊糖戊糖C1*顺式和反式构象的定义顺式和反式构象的定义:相对于糖的一部分相对于糖的一部分,碱基沿糖苷键碱基沿糖苷键C-N(对于嘧对于嘧啶是啶是N1,对嘌呤是对嘌呤是N9)。可以采取。可以采取2种主要的取向种主要的取向,顺式和反式构象。顺式和反式构象。假尿苷假尿苷514.核苷酸核苷酸1234553环核苷酸环核
21、苷酸cAMP、cGMP表示磷酸与表示磷酸与3、5核苷核苷羟基相接羟基相接（二）、游离核苷酸的功能（二）、游离核苷酸的功能ATP、GTP、UTP、CTP参于代谢参于代谢5FU（5氟尿嘧啶）氟尿嘧啶）抗癌药物抗癌药物6MP（6巯基嘌呤）巯基嘌呤）抗癌药物抗癌药物5-碘脱氧尿苷碘脱氧尿苷治疗病毒性心肌炎治疗病毒性心肌炎AZT抗抗AIDS病毒病毒（Azidothymidine叠氮基胸苷）叠氮基胸苷）cAMP、cGMP第二信使第二信使 （三）（三）DNA的一级结构的一级结构1.DNA的一级结构是指脱氧核苷酸的一级结构是指脱氧核苷酸（碱基）在（碱基）在DNA分子中的排列顺序分子中的排列顺序2.DNA分子中
22、脱氧核苷酸的连接方式分子中脱氧核苷酸的连接方式3，5磷酸二酯键磷酸二酯键3.直线形直线形DNA有二个末端：有二个末端：5磷酸末端磷酸末端3羟基末端羟基末端 A.分子结构式分子结构式B线条式线条式C字母式字母式1)端粒端粒DNA的结构的结构真核生物线性染色体末端的真核生物线性染色体末端的DNA序列序列,称为端粒。称为端粒。端粒端粒DNA序列相当保序列相当保守，守，端粒端粒DNA的的3末端是由数百个串联的重复末端是由数百个串联的重复序列序列，长长5-10kb。重复重复序列由序列由G-T丰富的丰富的6个核苷酸个核苷酸组成。组成。人人:5-AGGGTTAGGGTT-34.端粒（端粒（telomere）
23、DNA结构与功能结构与功能荧光原位杂交显示端粒和端粒序列荧光原位杂交显示端粒和端粒序列端粒的重复序列是由端粒酶（端粒的重复序列是由端粒酶（telomerase）合成后添合成后添加到染色体末端。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，加到染色体末端。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，具有逆转录酶的性质，以物种专一的内在具有逆转录酶的性质，以物种专一的内在RNA为模板，为模板，把合成的把合成的DNA添加到染色体的添加到染色体的3端。端。端粒起到端粒起到细胞分裂计时器细胞分裂计时器的作用，核苷酸复制和基的作用，核苷酸复制和基因因DNA每复制一次，端粒减少每复制一次，端粒减少50-100 bp，正常体正常体细胞染色
24、体缺乏端粒酶活性，故随细胞分裂而变短，细胞染色体缺乏端粒酶活性，故随细胞分裂而变短，细胞随之衰老。人的生殖细胞，部分干细胞染色体，细胞随之衰老。人的生殖细胞，部分干细胞染色体，肿瘤细胞和永生细胞系具有端粒酶活性。肿瘤细胞和永生细胞系具有端粒酶活性。2）端粒）端粒DNA的功能的功能a保证线性保证线性DNA的完整复制的完整复制b维持染色体的稳定维持染色体的稳定c决定细胞的寿命决定细胞的寿命2009诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔生理学或医学奖-端粒酶（端粒酶（telomerase）Elizabeth Blackburn Jack Szostak Carol Greider 1)DNA分子十分巨大，最小的
25、分子十分巨大，最小的DNA分子分子也包含有几千也包含有几千bp，分子量在，分子量在106以上。以上。人类基因组含有约人类基因组含有约3.1647109bp。5.DNA的一级结构特点的一级结构特点2)每一物种每一物种DNA都具有其特有的碱基都具有其特有的碱基组成组成3)有些碱基常被甲基修饰，称为甲基有些碱基常被甲基修饰，称为甲基化化(methylation)(1)细菌细菌DNA甲基化甲基化各种细菌都具有一定的甲基化模式，各种细菌都具有一定的甲基化模式，在在DNA分子中平均分子中平均1%的碱基被甲的碱基被甲基化。基化。甲基化最多的是腺嘌呤和甲基化最多的是腺嘌呤和胞嘧啶胞嘧啶细菌细菌DNA甲基化作用
26、的生物学意义甲基化作用的生物学意义a.影响影响DNA的构象的构象,影响蛋白质与影响蛋白质与DNA的的相互作用相互作用,以调节以调节DNA复制、转录、修复制、转录、修复、重组和包装的过程。复、重组和包装的过程。如：发生在如：发生在-GATC-的腺嘌呤，于的腺嘌呤，于DNA复制产生的错误碱基修复中起作用复制产生的错误碱基修复中起作用b.多发生于内切酶酶切位点，防止噬菌体多发生于内切酶酶切位点，防止噬菌体入侵，是一种细菌自身保护机制。入侵，是一种细菌自身保护机制。(2)真核细胞的真核细胞的DNA甲基化甲基化真核细胞真核细胞DNA中中胞嘧啶胞嘧啶甲基化最多，甲基化最多，约约5%,甲基化为甲基化为5-甲
27、基胞嘧啶，大多甲基胞嘧啶，大多数甲基化发生在数甲基化发生在CpG重复序列中。重复序列中。真核细胞中甲基化酶与去甲基化酶成真核细胞中甲基化酶与去甲基化酶成双成对存在，都对双成对存在，都对CpG二核苷酸序列二核苷酸序列有特异性，使甲基化与去甲基化成为有特异性，使甲基化与去甲基化成为可逆的生物学过程。可逆的生物学过程。多种基因的启动子区和第一外显子（多种基因的启动子区和第一外显子（60）富含富含CpG，称为，称为CpG岛，通常为非甲基化岛，通常为非甲基化状态状态。散在的散在的CpG则为甲基化的。则为甲基化的。DNA甲基化通常抑制基因表达，与人类甲基化通常抑制基因表达，与人类发育和肿瘤疾病关系密切。发
28、育和肿瘤疾病关系密切。*CpG岛：岛：在基因的末端通常存在一些富含在基因的末端通常存在一些富含双核苷酸双核苷酸“CG”的区域，称为的区域，称为“CpG岛岛”通过分析通过分析5-甲基胞嘧啶在真核细胞基因组甲基胞嘧啶在真核细胞基因组中的分布中的分布,发现发现CpG岛的存在，这些区域岛的存在，这些区域是是非甲基化非甲基化的，通常为的，通常为1-2kb，绝大多数，绝大多数在基因的在基因的5末端。末端。在人类基因组内，存在有近在人类基因组内，存在有近3万个万个CpG岛；岛；在大多数染色体上，平均每在大多数染色体上，平均每100万碱基含万碱基含有有515个个CpG岛，这些岛，这些CpG岛不仅是基岛不仅是基
29、因的一种标志，而且还参与基因表达的调因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。控和影响染色质的结构。6.DNA的一级结构的测定的一级结构的测定1)双脱氧末端双脱氧末端终止法终止法Sanger法法2)化学法化学法Maxan-Gilbert法法Sanger双脱氧末端双脱氧末端终止法测序的基本原理终止法测序的基本原理Maxan-Gilbert化学法测序基本原理化学法测序基本原理DNA自动序列测定的基本原理自动序列测定的基本原理第一步：加入复制终止剂第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快第二步：荧光检测DNA全自动分析仪：全自动分析仪：ABI Prism 3700型全自动型
30、全自动遗传分析仪遗传分析仪安玛西亚安玛西亚DNA序列分析系统型号：序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000（四）（四）DNA的二级结构的二级结构 Dr.Crick Dr.Watson1.DNA双螺旋结构双螺旋结构的提出的提出Watson和和Crick在在1953年提出了著年提出了著名的名的DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型。这个模。这个模型不仅解释了型不仅解释了DNA的理化性质，而的理化性质，而且将结构与功能联系起来，大大推且将结构与功能联系起来，大大推动了分子生物学的发展。动了分子生物学的发展。*双螺旋提出的根据双螺旋提出的根据1)DNA纤维晶体的纤维晶体的x-衍射研究
31、衍射研究1952年年Wilkins等等2)Chargaff的碱基分析的碱基分析ATGCATGC的比值的比值不同来源不同来源DNA是不同的是不同的3)碱基和核苷酸的结晶学资料碱基和核苷酸的结晶学资料 ChargaffChargaff原则原则原则原则 （1 1 1 1）不同种生物）不同种生物）不同种生物）不同种生物DNADNADNADNA分子中的核苷酸排列顺序不同分子中的核苷酸排列顺序不同分子中的核苷酸排列顺序不同分子中的核苷酸排列顺序不同 （有种族特异性）（有种族特异性）（有种族特异性）（有种族特异性）（2 2 2 2）同种生物不同组织器官细胞中）同种生物不同组织器官细胞中）同种生物不同组织器官
32、细胞中）同种生物不同组织器官细胞中DNADNADNADNA分子的核苷酸分子的核苷酸分子的核苷酸分子的核苷酸 排列顺序相同排列顺序相同排列顺序相同排列顺序相同 (无组织器官特异性无组织器官特异性无组织器官特异性无组织器官特异性)（3 3 3 3）某一特定生物，其）某一特定生物，其）某一特定生物，其）某一特定生物，其DNADNADNADNA碱基组成恒定碱基组成恒定碱基组成恒定碱基组成恒定（4 4 4 4）任何生物）任何生物）任何生物）任何生物DNADNADNADNA碱基组成都符合碱基组成都符合碱基组成都符合碱基组成都符合 A=TA=TA=TA=T，G=CG=CG=CG=C，A+G=T+CA+G=T
33、+CA+G=T+CA+G=T+Ca.DNA双链反向平行双链反向平行b.碱基配对碱基配对*ATGC*碱基是一个平面环分子。碱基平面垂直碱基是一个平面环分子。碱基平面垂直于螺旋轴于螺旋轴*相邻碱基相距相邻碱基相距0.34nm，每，每10个碱基旋个碱基旋转转1圈，双螺旋螺距为圈，双螺旋螺距为3.4nm，相邻两个，相邻两个碱基正好相差碱基正好相差3602.DNA的双螺旋的双螺旋结构的特点：结构的特点：1)B型型DNA结构结构 碱基配对结构碱基配对结构基基c在在DNA双螺旋分子上交替存在着双螺旋分子上交替存在着大沟和小沟大沟和小沟蛋白质通过大沟和小沟识别碱基序蛋白质通过大沟和小沟识别碱基序列的特异性，其
34、中大沟对于的识别、列的特异性，其中大沟对于的识别、结合尤为重要。结合尤为重要。d d维持双螺旋的力量维持双螺旋的力量 氢键氢键 碱基堆积力（碱基堆积力（base stacking forcebase stacking force）碱基平面叠在一起，存在碱基平面叠在一起，存在Van Van derder Waals Waals力力 碱基碱基 疏水性，在双螺旋内部形成疏水的力量疏水性，在双螺旋内部形成疏水的力量离子键离子键3.DNA的右手螺旋和左手螺旋的右手螺旋和左手螺旋*DNA构象与核苷酸顺序碱基组成有关构象与核苷酸顺序碱基组成有关并取决于环境条件（盐类、相对湿度）并取决于环境条件（盐类、相对湿
35、度）*主要构象类型：主要构象类型：右手螺旋：右手螺旋：A、B、C、D、E、T型型DNA左手螺旋：左手螺旋：Z型型DNA湿度和盐类对湿度和盐类对DNA构象的影响构象的影响多核苷酸多核苷酸盐类盐类 相对湿度相对湿度 构象类型构象类型Na+75ANa+92BLi+44CLi+66BT2噬菌体DNANa+60TDNA RNA杂合链Na+3392A天然RNA（逆转录病毒）Na+高达92ANa+43ZNa+高达92ALi+81B天然DNAPoly(dG-dC)右手螺旋右手螺旋1）B型型生理条件下最普遍的形式生理条件下最普遍的形式2）A型型RNA双螺旋及双螺旋及DNARNA杂交链（空间位阻小，有利于转录）杂
36、交链（空间位阻小，有利于转录）3）C型型线粒体线粒体DNA及一些病毒及一些病毒4）D型、型、E型型存在于噬菌体等生物中存在于噬菌体等生物中3.左手螺旋左手螺旋Z型型DNA1)发现发现:1979年年A.Rich等人工合成六聚体等人工合成六聚体d（CGCGCG）单晶进行）单晶进行X射线射线衍射分析，数据表明是衍射分析，数据表明是Z型骨架型骨架,左手双螺旋左手双螺旋DNA2)ZDNA的结构特点的结构特点:每个螺旋由每个螺旋由12个碱基对构成，螺距个碱基对构成，螺距4.46nm，直径，直径1.8nmb.脱氧胞苷的碱基取反式构象，脱氧脱氧胞苷的碱基取反式构象，脱氧鸟苷的碱基是顺式。在鸟苷的碱基是顺式。在
37、ZDNA中中GC交替而出现顺式和反式构象交替而出现顺式和反式构象交替。使糖交替。使糖-磷酸的主链的走向呈磷酸的主链的走向呈“之之”字型，这字型，这 样样Z-DNA主链呈锯主链呈锯齿状（齿状（Zig-Zag）走向。）走向。c.大沟消失，小沟变深大沟消失，小沟变深d.体内存在的体内存在的Z-DNA序列特点序列特点:(1)DNA序列必须是嘌呤嘧啶交替排列序列必须是嘌呤嘧啶交替排列如：如：CGCGCGGCGCGC(2)序列中必须有序列中必须有5-甲基胞嘧啶的存在甲基胞嘧啶的存在E.与与Z-DNA结合的特殊蛋白质结合的特殊蛋白质FZ-DNA有利于有利于DNA的负超螺旋的负超螺旋打开打开G抗抗Z-DNA抗
38、体抗体3）Z-DNA的功能：的功能：基因表达有关基因表达有关Z-DNA抗体常常紧密地结合在染色抗体常常紧密地结合在染色体的疏松部位体的疏松部位,增强转录活性的位点。增强转录活性的位点。基因调控基因调控Hochschild等报道等报道,一旦发现细菌调控一旦发现细菌调控蛋白紧密结合于它的调控位点蛋白紧密结合于它的调控位点,就通过就通过RNA聚合酶来激活相关基因的表达聚合酶来激活相关基因的表达,Z-DNA可能参与识别调控蛋白质。可能参与识别调控蛋白质。基因重组基因重组Willia等做的黑粉菌实验指出等做的黑粉菌实验指出,Z-DNA在基因重组中起非常重要的过渡作用在基因重组中起非常重要的过渡作用.在黑
39、粉菌中有一种在黑粉菌中有一种rec1酶能使染色体酶能使染色体第一次配对后互相交换片段第一次配对后互相交换片段,在配对时在配对时由由rec1酶使酶使Z-DNA的双链产生的双链产生,并且这并且这种酶与种酶与Z-DNA亲和力比亲和力比B-DNA高高75倍倍,Z-DNA与与rec1酶紧密结合是这一酶紧密结合是这一时期的主要特征时期的主要特征.疾病治疗与新药开发疾病治疗与新药开发Kim等研究表明等研究表明,一种关键的痘病毒蛋一种关键的痘病毒蛋白白E3L蛋白蛋白(已知该蛋白是病毒摧毁动已知该蛋白是病毒摧毁动物细胞的防御系统所必需的物细胞的防御系统所必需的)是通过是通过Z-DNA结合、干扰防御系统的运行来结
40、合、干扰防御系统的运行来行使功能的。行使功能的。E3L是牛痘的致病蛋白是牛痘的致病蛋白质之一，通过修饰该蛋白质的活跃位质之一，通过修饰该蛋白质的活跃位点可以使其丧失功能。点可以使其丧失功能。表表2右手螺旋与左手螺旋右手螺旋与左手螺旋DNA分子的比较分子的比较_项项目目A-DNAB-DNAZ-DNA_螺旋方向螺旋方向右旋右旋右旋右旋左旋左旋每转每转1圈碱基数圈碱基数1110412螺旋直径螺旋直径2.55nm2.37nm1.84nm螺距螺距2.46nm3.32nm4.56nm碱基平面的倾角碱基平面的倾角19olo9o大沟大沟窄，很深窄，很深宽，较深宽，较深平平小沟小沟很宽，浅很宽，浅窄，较深窄，较
41、深很窄很窄,深深_4.三螺旋三螺旋DNA（HDNA）三螺旋三螺旋DNA（triple-helicalDNA)三链三链DNA（triplestrandsofDNA)是一条是一条DNA链在链在DNA的大沟与的大沟与DNA双螺旋中的一条双螺旋中的一条DNA链以氢键相结链以氢键相结合形成的三股螺旋结构。合形成的三股螺旋结构。1）三螺旋）三螺旋DNA结构：结构：（1）三螺旋三螺旋DNA是在是在DNA双螺旋结构的双螺旋结构的基础上形成的，三链区的三链均为基础上形成的，三链区的三链均为同型嘌呤（同型嘌呤（homopurineHPU）或）或同型嘧啶同型嘧啶(homopyrimidineHPY）（2）根据三条链
42、组成及相对位置又可分为根据三条链组成及相对位置又可分为 Pu-Pu-Py（偏碱性介质中稳定）（偏碱性介质中稳定）Py-Pu-Py（偏酸性介质中稳定）（偏酸性介质中稳定）（3）链中的碱基配对方式两个碱基符合链中的碱基配对方式两个碱基符合Watson-Crick碱基配对碱基配对“-”，另个，另个碱基碱基按按Hoogsteen模型模型“”即即TA-TCG-C(第三位上的第三位上的“C”必须质子化必须质子化)A A-T嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸嘌呤核苷酸(a)嘧啶嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶三螺旋嘧啶三螺旋DNA序列序列(b)三螺旋三螺旋DNA结构示意图结构示意图ab2）生物学意义及应用：生物学意义及应用
43、：(1)三螺旋三螺旋DNA结构常位于结构常位于DNA一些一些重要的部位。如复制的起始点或终重要的部位。如复制的起始点或终点，转录的调控区或调节蛋白结合点，转录的调控区或调节蛋白结合位点以及位点以及DNA重组位点，提示与这重组位点，提示与这些功能相关。些功能相关。(2)丰富了丰富了DNA结构学说结构学说b.用寡聚用寡聚DNA片段封闭转录因子结合片段封闭转录因子结合点关闭有害基因活病毒基因。点关闭有害基因活病毒基因。（抗肿瘤，病毒，寄生虫等）（抗肿瘤，病毒，寄生虫等）(3)基因治疗中的应用基因治疗中的应用a.单链单链DNA片段可携带切割剂（核酸片段可携带切割剂（核酸内切酶，内切酶，EDTA-Fe等
44、）携带至等）携带至DNA的特定位点，选择性切断的特定位点，选择性切断DNA。5.四螺旋四螺旋DNA1)发现在真核染色体末端含有一个发现在真核染色体末端含有一个富含富含G的单链的单链DNA尾巴，它在体内尾巴，它在体内的超螺旋的超螺旋应力作用下，可自身回折应力作用下，可自身回折形成形成HoogsteenG-G碱基对。两个碱基对。两个DNA分子或染色体分子可彼此连接分子或染色体分子可彼此连接起来形成一个局部的四螺旋结构。起来形成一个局部的四螺旋结构。2)四螺旋四螺旋DNA的结构的结构*四螺旋结构由多个四螺旋结构由多个G-四碱基体形四碱基体形成右手螺旋，每圈含成右手螺旋，每圈含13个四碱基个四碱基体体
45、DNA。*在四碱基体中，四条链以对称和反在四碱基体中，四条链以对称和反对称构象交替存在。对称构象交替存在。3)可能的生物学意义可能的生物学意义两个两个DNA分子或染色体分子可彼此连分子或染色体分子可彼此连接起来形成一个局部的四螺旋结构接起来形成一个局部的四螺旋结构,这种这种结构可能起着稳定染色体的作用结构可能起着稳定染色体的作用（五）（五）DNA超螺旋结构（三级结构）超螺旋结构（三级结构）1.DNA三级结构就是指双螺旋三级结构就是指双螺旋DNA链链进一步扭曲、盘旋形成超螺旋结构。进一步扭曲、盘旋形成超螺旋结构。*超螺旋：超螺旋：负超螺旋（负超螺旋（negativesupercoil）正超螺旋正
46、超螺旋(positivesupercoil)2.生物体的闭环生物体的闭环DNA都以超螺旋形式都以超螺旋形式存在存在,如质粒、病毒、线粒体的如质粒、病毒、线粒体的DNA（六）真核生物染色体（六）真核生物染色体DNA真核生物真核生物DNA分子呈线状，其超螺旋分子呈线状，其超螺旋结构不同于上述环状结构不同于上述环状DNA。它们主要存。它们主要存在于染色体，以在于染色体，以核小体核小体的形式再进一步的形式再进一步盘绕折叠。盘绕折叠。*核小体核小体Nucleosome 1 1）核小体核心：组蛋白）核小体核心：组蛋白HistoneHistone八聚体八聚体 （H2A,H2B,H3,H4H2A,H2B,H3
47、,H4各两分子）各两分子）各两分子）各两分子）1.75圈圈DNA超螺旋（超螺旋（146bp）2 2）连接区：组蛋白）连接区：组蛋白H1 和和 20-80bpDNA双螺旋双螺旋DNA（2nm）核小体链（核小体链（11nm，每个核小体，每个核小体200bp）纤丝（纤丝（30nm，每圈，每圈6个核小体）个核小体）突环（突环（150nm，每个突环大约，每个突环大约75000bp）玫瑰花结（玫瑰花结（300nm，6个突环）个突环）螺旋圈（螺旋圈（700nm，每圈，每圈30个玫瑰花）个玫瑰花）染色体（染色体（1400nm，每个染色体含每个染色体含10个玫瑰花个玫瑰花200bp）真核生物染色体真核生物染色体
48、DNA组装组装DNA的质量、长度和浓度计算方法的质量、长度和浓度计算方法1.长度长度0.34bp=（nm)2.分子质量分子质量660bp=（dal)3.浓度浓度50OD260nm=g/ml(光径为光径为1cm)(七七)DNA的变性、复性和杂交的变性、复性和杂交1.变性（变性（denaturation)1）概念）概念：当当DNA的二级结构和三级结构受到物理的二级结构和三级结构受到物理化学等因素的破坏而解体，其一级结构核化学等因素的破坏而解体，其一级结构核苷酸间共价键并不断裂，使配对碱基间氢苷酸间共价键并不断裂，使配对碱基间氢键断裂，有序的螺旋解离成无序单链的过键断裂，有序的螺旋解离成无序单链的过
49、程称为变性。程称为变性。*引起变性的因素：引起变性的因素：常见的有加热、酸、碱、乙醇、常见的有加热、酸、碱、乙醇、丙酮、尿素、甲酰胺等作用，丙酮、尿素、甲酰胺等作用，2)变性过程中变性过程中DNA物化性质发生改变物化性质发生改变增色效应增色效应(hyperchromiceffect)浮力密度浮力密度黏度黏度旋光度变小旋光度变小沉淀速度沉淀速度3）DNA的熔解曲线的熔解曲线(meltingcurve)熔解温度（熔解温度（meltingtemperature,Tm）通常将通常将50%DNA分子变性时的温度分子变性时的温度称为熔解温度。称为熔解温度。*一般一般DNA在生理条件下在生理条件下Tm在在8
50、5-95oC之间之间DNA的熔解曲线的熔解曲线(2)影响影响Tm的因素的因素.DNA的碱基组成的碱基组成（GC）Tm（GC）每增加）每增加1,Tm线性增加线性增加0.41（GC）为）为40，Tm为为87（GC）为）为60，Tm为为95.介质中的离子强度介质中的离子强度盐浓度盐浓度Tm,变性过程跨越的温变性过程跨越的温度范围更狭窄度范围更狭窄,如单价离子浓度增如单价离子浓度增加加10倍倍,Tm增加约增加约16.6.变性剂变性剂50甲酰胺可使甲酰胺可使Tm降低降低30.DNA的均一性的均一性离子强度对离子强度对Tm的影响的影响2.复性复性(renaturation)(1)概念：概念：变性的两条变性