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1、天然天然DNADNA的制备的制备基因工程基因工程1 基因工程概论基因工程概论2 天然天然DNA的制备的制备3 分子克隆工具酶分子克隆工具酶4 分子克隆载体分子克隆载体5 表达载体表达载体 6 PCR技术及其应用技术及其应用 7 基因文库的构建基因文库的构建 8 基因克隆的筛选策略基因克隆的筛选策略 10 细菌基因工程细菌基因工程 11 酵母基因工程酵母基因工程 12 植物基因工程植物基因工程 13动物基因工程动物基因工程 14 基因工程的安全基因工程的安全9 转基因及其表达转基因及其表达茎环与发夹茎环与发夹tRNA二级结构二级结构 三叶草三叶草tRNA三级结构三级结构rRNA核糖体核糖体DNA
2、超螺旋超螺旋核小体核小体 核小体核小体 mRNA功能功能（遗传密码)密码子简并简并 通用通用 连续连续线粒体密码子tRNAtRNA功能功能转运氨基酸转运氨基酸遗传信息的传递与表达遗传信息的传递与表达2.1.1.3 DNA的半保留复制的半保留复制 复制起点复制起点:富含AT，其侧面是富含GC的回文结构。复制子：复制子：从起点开始复制出一个DNA分子或片段的序列。包括单、多复制子。复制必须因子：复制必须因子：DNA聚合酶、底物（dNTP）、寡聚核苷酸引物、模板等。旧链旧链 新链新链 新链新链 旧链旧链 2.1.1.4 DNA分子的重要特性分子的重要特性 1）变性：）变性：在一定的条件下，DNA双链
3、因链间氢键破坏而解链的过程。如温度变性，90足以使所有的DNA变性；其他,如pH、离子强度、脱水剂等。2）复性：）复性：变性DNA分子因链间氢键恢复而重新形成双链DNA的过程。若是温度变性，当缓慢降低温度时，该过程得以进行。以上是PCR反应的依据。3）带电性：）带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。4）水溶解性：）水溶解性：DNA属于生物大分子，且带电荷，通常分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是DNA提取和分离的依据。2.1.2 基因的结构和遗传密码基因的结构和遗传密码2.1.2.1 原核生物基因的结构原核生物基因的结构2.1.2.2 真核生物基因
4、的结构真核生物基因的结构2.2 天然天然DNA的制备的制备2.2.1 天然天然DNA的来源和用途的来源和用途 1）染色体）染色体DNA：用于分离目的基因或基因表达调控因子（promoter,enhancer）、提供构建染色体载体和染色体基因整合平台。2）病毒和噬菌体）病毒和噬菌体DNA：编码结构基因；可用于克隆启动子，如CaMV 35S 启动子；主要用于构建基因克隆载体，最大优点是可以体外包装，如CaMV、SV40、M13、T4、T7、-174。3）质粒）质粒DNA：微生物中存在的游离于核外的DNA，因具有复制起点，能自我复制，1103 kb。主要用于构建基因克隆载体，如大肠杆菌、农杆菌和蓝细
5、菌等的质粒；少数含有结构基因。4）细胞器）细胞器DNA：主要有线粒体和叶绿体DNA，用于分离目的基因或基因表达调控因子，也可于构建克隆载体。2.2.2 天然天然DNA的提取的提取2.2.2.1 原理原理 1）生物材料的准备）生物材料的准备 使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。如细菌培养至对数生长期后期；植物材料用幼嫩植株，且暗培养12天或黄化苗；动物以 肝脏为好，须将胆囊除尽。2）细胞的裂解）细胞的裂解 裂解不够，DNA得率低；裂解过猛，DNA断裂。细菌可用溶菌酶、NaOH+SDS、煮沸、冰冻或超声波等方法处理。动植物组织，先粉碎材料，再裂解细胞。3）DNA的分
6、离和抽提的分离和抽提 根据待提DNA的性质，将其与其他组分分离，进一步抽提DNA。一般先按1:1（V:V）用酚、酚+氯仿、氯仿对裂解液分别进行抽提，以除去蛋白质，然后按2:1用乙醇（V:V）或1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下（加1/10 体积的 3M NaAc pH4.8）沉淀DNA。注意：注意：提取细胞器、病毒或噬菌体DNA时，必须先从裂解液中分离出完整的细胞器、病毒或噬菌体，并用DNase处理附着在其表面的其他DNA。提取质粒DNA时，先调节裂解液的pH值到12.6，使所有 DNA沉淀，再调节pH值到中性，使质粒DNA复性从沉淀中释放出来。用RNase水解除去RNA。2.2.2.2 实
7、例实例 1）质粒DNA（实验）2）噬菌体DNA（自学）3）植物基因组DNA（实验）4）动物基因组DNA（自查资料学习）2.3 DNA的纯化的纯化 1）氯化铯溴化乙锭连续梯度离心法）氯化铯溴化乙锭连续梯度离心法 纯化剂量大、纯度高的DNA，须有超速离心机、氯化铯（昂贵），时间长。操作步骤如下：DNA 样品预处理：样品预处理：DNA溶液置离心管，每毫升加1g固体氯化铯，30下缓慢溶解，再加溴化乙锭（EtBr或EB）溶液（10 mgml）至终浓度 0.7 mgml。溶液中氯化铯终浓度为 1.55 gml，折射率为 1.3860。超离心：超离心：室温下8000 rmin离心5 min，吸取液面浮渣下的
8、清液置于一塑料离心管中，用液体石蜡盖在液面上，20下以45000 r/min 离心3640 h。收集收集DNA：紫外灯下观察DNA带。在DNA带下方用21号针头刺穿离心管壁收集DNA。除除EB：在收集液中加等体积正丁醇（水饱和），混匀，离心(1500 rmin)3 min，取水相。如此处理 46次，直至水相液体在紫外灯下无橘红色。除氯化铯除氯化铯:透析法。2)离子交换层析法离子交换层析法 原理：原理：DNA磷酸基团与固相材料上的离子相互作用，结合于层析柱固体介质，用浓度梯度盐溶液可将结合的离子洗脱。三烃甲基氯化铵层析树脂法三烃甲基氯化铵层析树脂法:DNA在低盐浓度（0.1 0.5 mmolL
9、NaCl）下与树脂结合，且双链 会比单链 结合牢，分子大的比小的结合牢，线形比环状分子结合牢。因此，当层析柱平衡后，可用 0.52.0 mmolL的梯度浓度NaCl溶液洗脱DNA，分部收集洗脱液，经核酸紫外检测仪检测，确定含有待纯化DNA的洗脱液，再经透析除去NaCl，获得纯的DNA。羟基磷灰石法：羟基磷灰石法：低盐浓度溶液中，DNA和RNA的磷酸基团通过与羟基磷灰石的钙离子相互作用而结合，随后用浓度梯度磷酸盐溶液洗脱和回收DNA或RNA。单链DNA(或RNA)的磷酸基团比双链少，结合的牢固度低于双链，洗脱时先被洗脱。于是，可分部洗脱单链DNA（或RNA）和双链DNA。用核酸紫外检测仪确定待纯
10、化 DNA的洗脱液，再经透析除去磷酸盐。3)琼脂糖凝胶电泳洗脱法琼脂糖凝胶电泳洗脱法 此法适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收。DNA样品 电泳 切胶 装(透析)袋或框 加稀释电泳缓冲液(1/10 l/2),稀释缓冲液电泳 12 h 反向电泳3060 Sec 洗脱液置离心管 离心 转上清入新管 乙醇沉淀 离心 晾干 溶于TE（TE:10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA）。4)从从DNA样品中去掉样品中去掉EB 经凝胶电泳回收和氯化铯浓度梯度高心制备的DNA样品，含有EB，影响酶切，因此，须去掉插入DNA中的EB。可以用正丁醇（或异戊醇）抽提等
11、方法。正丁醇（或异戊醇）抽提法：正丁醇（或异戊醇）抽提法：加等体积正丁醇(用溶解 DNA的缓冲液饱和)入DNA样品溶液，轻轻混合，待上下相液体分开后，弃去上相正丁醇。重复以上步骤至少一次，至上相正丁醇无桔红色。2.4DNA(RNA)的浓缩的浓缩 乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：在样品中加1/10 体积的NaAc、2倍体积的无水乙醇，冰上10 min 以上，4 下离心(12 000 g)10 min，去上清，70%乙醇（4）洗涤，去乙醇，干燥后溶入TE，20(RNA于80)保存。此法沉盐，影响酶切。异丙醇沉淀法：异丙醇沉淀法：在样品中加1倍体积的异丙醇，冰上10 min 以上，4 下离心(12 000
12、g以上)10 min，干燥后溶入TE，20(RNA于80)保存。此法不沉盐。正丁醇抽提法：正丁醇抽提法：向DNA溶液中加入1倍体积的正丁醇，充分混匀，以1600 r/min离心l min，弃上相液体。如此重复至液体达到所需要的体积。然后用水饱和的乙醚抽提DNA溶液两次，去除正丁醇。最后在空气中蒸发乙醚。聚乙二醇浓缩法：聚乙二醇浓缩法：将DNA溶液装人透析袋，置于高浓度的聚乙二醇(PEG600)溶液中，4 下使DNA溶液浓缩至所需要的体积1名词解释名词解释DNA变性；变性；DNA复性；复性；Tm值值 2简要回答下列问题简要回答下列问题n1）举例说明浓缩举例说明浓缩DNA或或RNA的方法。的方法。n2）简述简述DNA与基因工程有关的主要特性。与基因工程有关的主要特性。n3）简要说明天然简要说明天然DNA的主要提取过程。的主要提取过程。复习思考题复习思考题结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！38