《细胞生物学的研究方法.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞生物学的研究方法.pptx（166页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、学习目的与要求学习目的与要求1.掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用。掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用。2.熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。3.了解细胞生物学研究方法的进展。了解细胞生物学研究方法的进展。第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法Technology for Cell Biology第一节第一节第二节第二节第三节第三节中英文中英文退退 出出第四节第四节第五节第五节第六节第六节第1页/共166页第一节第一节 显微镜技术显微镜技术一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术三、纳米显微技术三、纳
2、米显微技术四、超分辨光学显微技术四、超分辨光学显微技术退退 出出首首 页页Technology for Cell Biology第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第2页/共166页(一一)普通光学显微镜的分辨率普通光学显微镜的分辨率1.分辨率（分辨率（resolution，R）显显微微镜镜或或人人眼眼在在25cm的的明明视视距距离离处处，能能分辨分辨 被检物体微细结构最小间隔的能力。被检物体微细结构最小间隔的能力。一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术Cell,2010(143):1047-1058退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第
3、三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第3页/共166页(一一)普通光学显微镜的分辨率普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术不同显微结构的尺寸不同显微结构的尺寸由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。Cell,2010(143):1047-1058退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第4页/共166页2.分辨率公式
4、分辨率公式n=聚光镜和物镜之间介质的折射聚光镜和物镜之间介质的折射 率，空气为率，空气为1，油为，油为1.5。=标本对物镜镜口张角的半角，标本对物镜镜口张角的半角，sin的最大值为的最大值为1。=照明光源的波长，白光照明光源的波长，白光0.5 m。横向分辨率横向分辨率 Rx,y=0.61/nsin 纵向分辨率纵向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法(一一)普通光学显微镜的分辨率普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第5页/共166页3.组织切片制备过程组
5、织切片制备过程 固定（固定（fixation）使大分子交联而保持在原有使大分子交联而保持在原有的位置上，防止结构移位或信息丢失。的位置上，防止结构移位或信息丢失。常用的固定剂：戊二醛、甲醛常用的固定剂：戊二醛、甲醛 包埋（包埋（embedding）使组织形使组织形 成硬块，便于切片。成硬块，便于切片。常用的包埋剂：石蜡、树脂常用的包埋剂：石蜡、树脂戊二醛戊二醛甲醛甲醛退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法(一一)普通光学显微镜的分辨率普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第6页/共166页
6、3.组织切片制备过程组织切片制备过程 切片（切片（section）切片厚度为切片厚度为110 m。染色（染色（staining）增大反差。增大反差。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法(一一)普通光学显微镜的分辨率普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第7页/共166页组织切片制备过程组织切片制备过程退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第8页/共166页宫颈鳞癌组织切片宫颈鳞癌组织切片退退 出出Tec
7、hnology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第9页/共166页(二二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像1.荧光和荧光染料荧光和荧光染料 荧光荧光荧荧光光分分子子可可以以在在吸吸收收特特定定波波长长的的光光后后，发发射射出出更更长长波波长长的的可可见见光光，称称为为荧荧光光。前前者者称称为为激激发发光光(excitation light)，后者称为发射光，后者称为发射光(emission light)。荧光染料荧光染料由由于于荧荧光光分分子子可可以以使使被被检检样样品品呈呈现现不不同同的的染染色色
8、，因因此此也也称称荧光染料。荧光染料。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第10页/共166页常见荧光分子的激发光与发射光波长范围常见荧光分子的激发光与发射光波长范围退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第11页/共166页荧光素荧光素(fluorescein)，绿色荧光绿色荧光四甲基罗丹明四甲基罗丹明(tetramethyrhodanmine)，红色荧光红色荧光退退 出出Technol
9、ogy for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第12页/共166页(二二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像2.荧光显微镜工作原理荧光显微镜工作原理荧光显微镜（荧光显微镜（fluorescence microscope）的结构特点：）的结构特点：以以高压汞灯和弧光高压汞灯和弧光作为光源。作为光源。两组两组滤光片。滤光片。荧光显微镜的光学系统荧光显微镜的光学系统退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学
10、显微镜技术第13页/共166页(二二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像3.应用应用成像反差强，检测灵敏度高。成像反差强，检测灵敏度高。定性、定位和定量定性、定位和定量的研究组织内的荧光标的研究组织内的荧光标记物质。记物质。对对活细胞活细胞内分子的内分子的动态动态变化进行实时观察。变化进行实时观察。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第14页/共166页(三三)相差显微镜通常被用于观察活细胞相差显微镜通常被用于观察活细胞波长变化波长变化振
11、幅变化振幅变化光速变化光速变化颜色变化颜色变化明暗变化明暗变化相位变化相位变化人眼能感知人眼能感知人眼不能感知人眼不能感知原理：原理：退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第15页/共166页相相差差显显微微镜镜（phase contrast microscope）：利利用用光光的的衍衍射射和和干干涉涉效效应应把把透透过过标标本本不不同同区区域域的的光光波波的的光光程程差差变变成成振振幅幅差差，使使活活细细胞胞内内各各种种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。结构之间呈现清晰可见
12、的明暗对比。(三三)相差显微镜通常被用于观察活细胞相差显微镜通常被用于观察活细胞应用：应用：活细胞观察活细胞观察退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第16页/共166页相差显微镜观察培养中的相差显微镜观察培养中的HeLa细胞细胞退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第17页/共166页相差显微镜下观察到的悬浮生长的昆虫草地夜蛾卵巢相差显微镜下观察到的悬浮生长的昆虫草地夜蛾卵巢Sf9细胞细
13、胞退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第18页/共166页原理：原理：散射光成像。散射光成像。应用：应用：分辨率不高。分辨率不高。适合观察适合观察活细胞活细胞内的细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。的细菌和真菌等。(四四)暗视野显微镜通过散射光成像暗视野显微镜通过散射光成像暗视野显微镜工作原理暗视野显微镜工作原理退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第
14、19页/共166页(五五)显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程 原理：原理：用显微电影摄影术或电视录像以用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔一定时间间隔拍摄。拍摄。应用：应用：准确记录细胞或细胞器的准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。运动过程和速度。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第20页/共166页(六六)共共聚聚焦焦激激光光扫扫描描显显微微镜镜可可以以提提供供高高清清晰晰的的彩彩色色 三维图像三维图像原理：原理
15、：单色激光单色激光作为光源。作为光源。共聚焦：共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像。参加成像。逐点扫描。逐点扫描。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第21页/共166页(六六)共共聚聚焦焦激激光光扫扫描描显显微微镜镜可可以以提提供供高高清清晰晰的的彩彩色色 三维图像三维图像应用：应用：进行连续的光学切片，通过电脑进行进行连续的光学切片，通过
16、电脑进行 三维重建。三维重建。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第22页/共166页共聚焦激光显微镜工作原理示意图共聚焦激光显微镜工作原理示意图退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第23页/共166页共聚焦激光显微镜下的血管内皮细胞微丝的分布共聚焦激光显微镜下的血管内皮细胞微丝的分布退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究
17、方法细胞生物学研究方法第24页/共166页共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像维图像退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第25页/共166页以以电子束电子束作光源，波作光源，波长短，分辨率高。长短，分辨率高。电子显微镜分辨率电子显微镜分辨率 理论值：理论值：0.002nm 实际值：实际值：0.1nm 生物样品：生物样品：2nm 电镜下观察到的结构电镜下观察到的结构称为称为超微结构。超微结构。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术退退 出
18、出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第26页/共166页(一一)透射电子显微镜（透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）光学显微镜与透射电子显微镜的比较光学显微镜与透射电子显微镜的比较退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第27页/共166页透射电子显微镜标本制备过程：固定：固定：双重固定双重固定锇酸锇酸固定固定脂类脂类，戊二醛戊二醛固定固定蛋蛋
19、白白。脱水：脱水：含水标本干扰观察。含水标本干扰观察。包埋：包埋：环氧树脂是常用包埋剂。环氧树脂是常用包埋剂。(一一)透射电子显微镜透射电子显微镜退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第28页/共166页透射电子显微镜标本制备过程 切片：切片：电子的穿透力有限，需制作超薄切片，厚度电子的穿透力有限，需制作超薄切片，厚度通常为通常为50100nm。染色：染色：生物分子散射电子能力弱，需通过重金属染生物分子散射电子能力弱，需通过重金属染色，增大反差，常用锇、铀、铅等重金属的盐类
20、。色，增大反差，常用锇、铀、铅等重金属的盐类。(一一)透射电子显微镜透射电子显微镜退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第29页/共166页(二二)扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）原理：原理：通过电子束照射在标本后产生的通过电子束照射在标本后产生的二次电子二次电子成像，二成像，二次电次电 子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关。子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关。应用：应用：可以直接观察标本表面的
21、可以直接观察标本表面的三维形态。三维形态。科学Scientific American 中文版退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第30页/共166页(二二)扫描电子显微镜扫描电子显微镜科学Scientific American 中文版退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第31页/共166页扫描电镜的工作原理扫描电镜的工作原理 退退 出出Technol
22、ogy for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第32页/共166页扫描电镜观察的有丝分裂中期染色体形态扫描电镜观察的有丝分裂中期染色体形态（中国医科大学宋今丹提供）退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第33页/共166页凋亡细胞及凋亡小体透射电镜照片凋亡细胞及凋亡小体透射电镜照片(左左)和扫描电镜照片和扫描电镜照片(右右)，显示凋亡细胞的细胞核固缩，凋亡小体正从细胞脱，显示凋亡细胞的细胞核固缩，凋亡小体正从细胞脱落。落。（中国医科大学宋今丹提供）中国医科
23、大学宋今丹提供）退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第34页/共166页(三三)透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像冻蚀刻技术可获取三维图像1.金属投影法（金属投影法（metal shadowing）原理：原理：以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示 投影效果，给出样品表面三维结构。投影效果，给出样品表面三维结构。应用：应用：观察蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及细胞壁观察蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及
24、细胞壁 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第35页/共166页2.冰冻断裂冰冻断裂（freeze-fracture）样品快速冷冻样品快速冷冻 冰刀从脂双层疏水部分撬开冰刀从脂双层疏水部分撬开 暴露膜内部构造暴露膜内部构造 样品制备：样品制备：应用：应用：观察细胞膜性结构的内部构造。观察细胞膜性结构的内部构造。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第3
25、6页/共166页2.冰冻断裂冰冻断裂（freeze-fracture）退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第37页/共166页叶绿体内膜冰冻断裂复形，显示内膜上存在大量膜蛋白叶绿体内膜冰冻断裂复形，显示内膜上存在大量膜蛋白退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第38页/共166页3.冰冻蚀刻（冰冻蚀刻（freeze-etch）冷冻组织冷冻组织 冰刀撬组织冰刀撬组织 真空中升华真空中升华
26、暴露膜结构暴露膜结构 应用：应用：观察细胞的内部构造。观察细胞的内部构造。样品制备：样品制备：退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第39页/共166页3.冰冻蚀刻（冰冻蚀刻（freeze-etch）退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第40页/共166页冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白纤维冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白纤维退退 出出Technolo
27、gy for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第41页/共166页 三、纳米显微技术三、纳米显微技术纳米尺度：纳米尺度：1nm100nm 生命是纳米尺度的分子活动，细胞是纳米组生命是纳米尺度的分子活动，细胞是纳米组装机的集合体。装机的集合体。扫描隧道显微镜和原子力显微镜的分辨率和扫描隧道显微镜和原子力显微镜的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平，被称作可操控的颗粒在纳米水平，被称作纳米显微技术纳米显微技术。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第42页/共166页
28、 三、纳米显微技术三、纳米显微技术退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第43页/共166页1.扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope,STM）原理：原理：使用使用原子尺度的探针原子尺度的探针在标本的表面进行扫描，在探针在标本的表面进行扫描，在探针 针尖和样品间施加一定电压，产生随标本表面形貌变针尖和样品间施加一定电压，产生随标本表面形貌变 化的化的隧道电流。隧道电流。特点：特点：分辨率高，可在大气和液体等非真空状态下工作。分辨率高，可在大气和液体等非真空状态
29、下工作。应用：应用：直接观察大分子的三维结构，如直接观察大分子的三维结构，如DNADNA双螺旋结构双螺旋结构。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 三、纳米显微技术三、纳米显微技术第44页/共166页1.扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope,STM）扫描隧道显微镜下的人红细胞血影退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 三、纳米显微技术三、纳米显微技术第45页/共166页2
30、.原子力显微镜原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）原理：原理：通过分析探针针尖与样品之间的通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力原子间作用力来获取所来获取所 观察表面的微观信息。观察表面的微观信息。特点：特点：可以在可以在三态三态（固态、气态和液态）（固态、气态和液态）状况下工作。状况下工作。应用：应用：活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测 进行单个分子操作。进行单个分子操作。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法
31、 三、纳米显微技术三、纳米显微技术第46页/共166页2.原子力显微镜原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）针尖的曲率半径通常为针尖的曲率半径通常为5-10nm5-10nm退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 三、纳米显微技术三、纳米显微技术第47页/共166页 原子力显微镜下的中国仓鼠卵巢细胞原子力显微镜下的中国仓鼠卵巢细胞 原子力显微镜下的神经母细胞瘤原子力显微镜下的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞细胞退退 出出Technology for Cell Biology首首 页
32、页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第48页/共166页原子力显微镜观察细胞膜原子力显微镜观察细胞膜表面，显示两种分子大小表面，显示两种分子大小不同的膜脂参与了此细胞不同的膜脂参与了此细胞膜的组成。膜的组成。原子力显微镜测定大分子原子力显微镜测定大分子间的作用力。左图中间的作用力。左图中DNA分子固定在支持物上，原分子固定在支持物上，原子力显微镜的探针吸附了子力显微镜的探针吸附了与与DNA分子结合的蛋白。分子结合的蛋白。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第49页/共166页四、超分辨光学显
33、微技术四、超分辨光学显微技术由光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称由光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称 为为Abbe限度限度(Abbe limit)。应用新的光学原理、发光应用新的光学原理、发光/示踪分子和信号分析示踪分子和信号分析 技术，建立起了能够突破技术，建立起了能够突破Abbe限度的限度的超分辨显超分辨显 微技术微技术，使光学显微镜的分辨率达到了，使光学显微镜的分辨率达到了3050nm 的纳米尺度。的纳米尺度。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第50页/共166页四、超分辨光学显微技术四
34、、超分辨光学显微技术光的衍射效应使物镜的焦点呈椭圆形光的衍射效应使物镜的焦点呈椭圆形(左左)；当两点间的距离大；当两点间的距离大于衍射限度时，物镜能够呈现两个像，如两根微管的横切面于衍射限度时，物镜能够呈现两个像，如两根微管的横切面A；当两点间的距离小于衍射限度时，物镜不能够呈现两个像，；当两点间的距离小于衍射限度时，物镜不能够呈现两个像，如两根微管的横切面如两根微管的横切面B。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第51页/共166页STED显微技术成像与共焦显微技术成像与共焦显微技术成像比较显微技术成像比
35、较以线粒体膜蛋白以线粒体膜蛋白TOM20为为标志蛋白，左上为共焦显标志蛋白，左上为共焦显微镜呈现的线粒体结构，微镜呈现的线粒体结构，右上为右上为STED显微镜呈现的显微镜呈现的线粒体结构。左下为线粒体结构。左下为TOM2和线粒体基质蛋白和线粒体基质蛋白HSP70在共焦显微镜下呈现的线在共焦显微镜下呈现的线粒体结构。右下为由粒体结构。右下为由STED技术重建的线粒体三维结技术重建的线粒体三维结构。构。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第52页/共166页SIM显微技术成像与共焦显微技术成像与共焦显微技术成像
36、比较显微技术成像比较将核孔复合体标记成红色，将核孔复合体标记成红色，核纤层蛋白核纤层蛋白B标记成绿色、标记成绿色、DNA标记成蓝紫色，用共标记成蓝紫色，用共焦显微镜呈现的细胞核中焦显微镜呈现的细胞核中间位置横切面结构，小图间位置横切面结构，小图为方框内的细微结构为方框内的细微结构(上上)；相同方法标记细胞核，；相同方法标记细胞核，SIM技术三维重建后呈现技术三维重建后呈现的细胞核中间位置横切面的细胞核中间位置横切面结构。结构。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第53页/共166页第二节第二节 细胞的分离和
37、培养细胞的分离和培养 一、细胞分离一、细胞分离二、细胞培养二、细胞培养离心方法离心方法 流式细胞术流式细胞术 免疫磁珠法免疫磁珠法 激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第54页/共166页从组织中分离细胞的第一步是将组织从组织中分离细胞的第一步是将组织制备成游离的制备成游离的细胞悬液。细胞悬液。一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离胰蛋白酶、胶原酶胰蛋白酶、胶原酶EDTA消除细胞间的连消除细胞间的连接和细胞外基质接和细胞外基质 细胞分离需根据不同细胞的特征采用
38、不同的方法。细胞分离需根据不同细胞的特征采用不同的方法。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第55页/共166页一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离(一一)离心方法离心方法 利用细胞的利用细胞的密度特性密度特性可有效分离不同的细胞。如可有效分离不同的细胞。如血浆白细胞和红细胞的分离。血浆白细胞和红细胞的分离。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第56页/共166页流式细胞仪（流式细胞仪（flow cytomete
39、r）：）：从多细胞悬从多细胞悬 液中分离目的细胞的精密仪器。液中分离目的细胞的精密仪器。样品处理：样品处理：用带有荧光的特异抗体标记待分离用带有荧光的特异抗体标记待分离 的细胞。的细胞。分离速度：分离速度：2万个细胞万个细胞/s。分离纯度：分离纯度：95%。(二二)流式细胞术流式细胞术退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离第57页/共166页(二二)流式细胞术流式细胞术Beckman FC500 流式细胞仪外形流式细胞仪外形流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理退退
40、出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离第58页/共166页Beckman FC500 流式细胞仪分析结果流式细胞仪分析结果退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第59页/共166页(三三)免疫磁珠法免疫磁珠法 利用带有特定单抗的利用带有特定单抗的免疫磁珠（免疫磁珠（immunomagnetic microsphere）与靶细胞的特异结合，快速地从多与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中
41、将目的细胞分离出来。细胞悬液中将目的细胞分离出来。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离第60页/共166页(三三)免疫磁珠法免疫磁珠法 分离纯度：分离纯度：9599 Fe2O3或或Fe3O4颗粒颗粒 +单克隆抗体单克隆抗体 免疫磁珠免疫磁珠退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离第61页/共166页(四四)激光俘获显微切割技术（激光俘获显
42、微切割技术（Laser Capture Microdissection，LCM）原理：原理：在载玻片上制作冰冻或石蜡切片并染色，通在载玻片上制作冰冻或石蜡切片并染色，通过直接的过直接的 显微镜观察，用能量较低的显微镜观察，用能量较低的红外红外激光切割激光切割而获得所需要的组织细胞，甚至单而获得所需要的组织细胞，甚至单个细胞。个细胞。应用：应用：从从组织切片组织切片中精确地分离一个中精确地分离一个单一的细胞单一的细胞 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离第62页/共
43、166页(四四)激光俘获显微切割技术激光俘获显微切割技术退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离第63页/共166页退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第64页/共166页 二、细胞培养二、细胞培养细胞培养细胞培养(cell culture)：从机体中取出组织或细胞，从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和增殖
44、的一种方法。增殖的一种方法。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第65页/共166页 二、细胞培养二、细胞培养1.条件条件 营养条件：营养条件：培养基：培养基：RPMI-1640、DMEM。血清。血清。5%CO2 无菌环境无菌环境退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第66页/共166页细胞培养的基本设细胞培养的基本设备备CO2培养箱CO2培养箱相差显微镜超净工作台退退 出出Technology for Cell Biol
45、ogy首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第67页/共166页2.原代培养和传代培养原代培养和传代培养原代培养（原代培养（primary culture）：）：直接取材于有机直接取材于有机 体组织的细胞培养。体组织的细胞培养。传代培养（传代培养（secondary culture）：）：原代培养的细原代培养的细 胞从培养瓶中取出，以胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例的扩以上的比例的扩 大培养。传代培养的细胞通常表现出其来源大培养。传代培养的细胞通常表现出其来源 组织的分化特征。组织的分化特征。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第
46、三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 二、细胞培养二、细胞培养第68页/共166页3.细胞系细胞系细胞系（细胞系（cell line）：）：在培养的细胞中产生在培养的细胞中产生“不死不死”的的 变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。细胞系的来源包括培养过程中发生转化的正常细胞和细胞系的来源包括培养过程中发生转化的正常细胞和取材于肿瘤组织的原代培养细胞。取材于肿瘤组织的原代培养细胞。细胞株（细胞株（cell strain）：）：用细胞克隆化的方法进一步改用细胞克隆化的方法进一步改 善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖善细胞系的均一性，即分离
47、出单个细胞使之增殖 形成的细胞群。形成的细胞群。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 二、细胞培养二、细胞培养第69页/共166页第三节第三节 细胞组分的分离和纯化技术细胞组分的分离和纯化技术一、细胞裂解一、细胞裂解二、细胞器及细胞组分的分级离心二、细胞器及细胞组分的分级离心三、蛋白质的分离与鉴定三、蛋白质的分离与鉴定四、核酸的分离纯化与鉴定四、核酸的分离纯化与鉴定退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第70页/共166页
48、一、细胞裂解一、细胞裂解在细胞组分的分级离心前，首先破碎细胞，制备细胞在细胞组分的分级离心前，首先破碎细胞，制备细胞匀浆液。匀浆液。方法：方法：低渗透压；低渗透压；超声振荡；超声振荡；强制通过微孔；强制通过微孔；机械破碎及研磨；机械破碎及研磨；去垢剂：去垢剂：如如SDS、TritonX-100、NP-40 常用于蛋白质的抽提；常用于蛋白质的抽提；离液剂：离液剂：如盐酸胍、尿素如盐酸胍、尿素 常用于细胞常用于细胞DNA和和RNA的抽提。的抽提。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第71页/共166页二、细胞二
49、、细胞器及细胞器及细胞组分的分级离心组分的分级离心 (一一)差速离心差速离心（differential centrifugation）方法：方法：从高速到低速逐级沉降。从高速到低速逐级沉降。分离对象：分离对象：体积、质量差别较大体积、质量差别较大 的颗粒的颗粒。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第72页/共166页(二二)速度沉降（速度沉降（velocity sedimentation）方法：方法：在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加 的的蔗糖溶液密度梯度蔗糖溶液密度梯度(
50、通常通常5%20%)。分离对象：分离对象：沉降系数沉降系数不同的颗粒。不同的颗粒。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、细胞二、细胞器及细胞器及细胞组分的分级离心组分的分级离心 第73页/共166页(三三)平衡沉降（平衡沉降（equilibrium sedimentation）方法：方法：在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的 蔗糖或氯化铯溶液密度梯度。蔗糖或氯化铯溶液密度梯度。分离对象：分离对象：密度密度不同颗粒。不同颗粒。退退 出出Technology for Cel