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1、第二章 细胞生物学研究方法 细胞生物学的研究方法归纳起来大体上可划分为四大类：形态观察、生化分析、生理检测、实验性操作形态观察、生化分析、生理检测、实验性操作技术。技术。光学显微镜（light microscope）电子显微镜（electron microscope）第一节 细胞形态结构的观察方法Figure 3-1.Figure 3-1.Resolving power.Resolving power.Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale,indicating the range of objects
2、that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes.肉眼：肉眼：0.2 mm;0.2 mm;光镜：光镜：0.2 um;0.2 um;电镜：电镜：0.2 nm0.2 nm尼康E-600E-600显微镜 一、光学显微镜一、光学显微镜（一一）普普通通光光学学显微镜显微镜普通显微镜由聚光器、物镜和目镜三部分组成。Light Light Pathway Pathway of of MicroscopeMicroscope普通显微镜最大放大倍数普通显微镜最大放大倍数100010001
3、5001500倍倍因为它的分辨率有限，再放大也是空放大因为它的分辨率有限，再放大也是空放大 分辨率（resolutionresolution）：能将物体相近两点分辨清楚的距离极限D=0.61D=0.61/N.A./N.A.代表光波波长；N.A.N.A.为镜口率，也称数值孔径。N.N.A.A.=n=n Sin Sin /2 /2 n n：物镜与标本间介质的折射率；（1 1或1.5151.515）：镜口角（聚光焦点对物镜镜 口的张角，180180）物镜镜口标本结论：结论：通过公式可知通过公式可知光学显光学显微镜最大分辨率微镜最大分辨率0.2um0.2um减小分辨率需减小 介质空气水香柏油溴萘折射率
4、11.331.5151.66显微镜的几个光学特点：sin /2 sin /2的最大值小于1 1；普通光线的波长为400700nm400700nm，光镜分辨力约为0.2m0.2m，人眼的分辨力为0.2mm0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X1000X。普通光学显微镜神经节细胞内高尔基体组织切片的制备组织切片的制备固定的目的是使细胞及其成分锁定在原有的位置，固定的目的是使细胞及其成分锁定在原有的位置，常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。常用的染色剂有苏木精、伊红、孔雀绿、苏丹黑、常用的染色剂有苏木精、伊红、孔雀绿、苏丹黑、考马斯亮蓝等，它们对细胞某一
5、特殊的亚细胞成分考马斯亮蓝等，它们对细胞某一特殊的亚细胞成分有特异的亲和性。有特异的亲和性。切片厚度切片厚度1-10um1-10um1.胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺蓝，美蓝，孔雀绿等。2.胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄G,酸性品红,苦味酸等。3.脂质染色剂：苏丹，苏丹，苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。细胞染色常用方法主要包括1.1.简单染色法简单染色法，常用碱性染料如美蓝等进行简单染色;2.2.革兰氏染色法革兰氏染色法，主要包括结晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脱色以及番红复染四个过程;微生物染色3.3.瑞氏染色法瑞氏染色法：瑞氏染料溶剂主要是由伊红-美蓝（亚甲基蓝）组成;4.4.吉姆萨染色
6、法吉姆萨染色法，吉姆萨染色原理与结果和瑞氏染色法基本相同，该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差，染色体显带染色G带5 5苏木素苏木素-伊红染色伊红染色 供组织学诊断用的优秀常规染色剂，可使胞核表现为蓝色，胞浆和结缔组织纤维呈各种色调的粉红，因此这是一种最常用的常规染色剂6.6.细胞免疫荧光染色法细胞免疫荧光染色法，免疫荧光染色的主要原理是利用抗原 抗体之间的特异性结合。有丝分裂中期固定的洋葱根尖细胞中，福尔根染色的结果，有丝分裂中期固定的洋葱根尖细胞中，福尔根染色的结果，特异显示特异显示DNADNA1.胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺蓝，美蓝，孔雀绿等。2
7、.胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄G,酸性品红,苦味酸等。3.脂质染色剂：苏丹，苏丹，苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。细胞染色常用方法主要包括1.1.简单染色法简单染色法，常用碱性染料如美蓝等进行简单染色;2.2.革兰氏染色法革兰氏染色法，主要包括结晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脱色以及番红复染四个过程;微生物染色3.3.瑞氏染色法瑞氏染色法：瑞氏染料溶剂主要是由伊红-美蓝（亚甲基蓝）组成;4.4.吉姆萨染色法吉姆萨染色法，吉姆萨染色原理与结果和瑞氏染色法基本相同，该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差，染色体显带染色G带5 5苏木素苏木素-伊红染色伊红染色 供组
8、织学诊断用的优秀常规染色剂，可使胞核表现为蓝色，胞浆和结缔组织纤维呈各种色调的粉红，因此这是一种最常用的常规染色剂6.6.细胞免疫荧光染色法细胞免疫荧光染色法，免疫荧光染色的主要原理是利用抗原 抗体之间的特异性结合。（二）紫外线显微镜（ultraviolet ultraviolet microscopemicroscope）根据光学原理，光源光波越短，显微镜的分辨本领越大。紫外线显微镜以紫外线为光源，分辨率可提高一倍。可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。可用来测定细胞中的核酸含量。透镜：石英、萤石（CaFCaF2 2)、碳酸锂等制作。价格昂贵，使用受限。（三）荧光显微镜（fluoresc
9、ent fluorescent microscopemicroscope）2020世纪4040年代在紫外线显微镜基础上发明。原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受激发光照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经过照射也可发荧光。荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。结构：在普通光学显微镜上添加一些附件：A.A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。B.B.滤片：根据性能分为两组。一是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；
10、选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。荧光显微镜荧光显微照片(微管绿,微丝红,核蓝)（四）暗 视 野 显 微 镜（dark dark field field microscopemicroscope）原理：显微镜加装挡光片，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜特点：视野的背景是暗的，样品的边缘是亮的。特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野光阑（五）相 差 显 微 镜（phase phase contrast contrast microscopemicroscope）相差显微镜由P PZernikeZerni
11、ke于19321932年发明，并因此获19531953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。原理：将透过标本的可见光的光程差（也就是相位差）变成明暗差（即振幅差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。构造：聚光器或光源上安装环状光阑(annular(annular diaphragm)diaphragm)；在物镜中加了环形相板(annular(annular phase phase plate)plate)。主主要要用用于于观观察察活活细细胞胞或或活活组组织织，是是体体外外细细胞胞和和组组织培养工作的重要工具。织培养工作的重要工具。相差显微镜
12、体外培养的Hela细胞（六）微分干涉相差显微镜（differential differential interference contrast interference contrast(DIC)microscope(DIC)microscope）19521952年，NormaskiNormaski在相差显微镜原理的基础上发明。能显示结构的三维立体投影影像。DIC DIC显微镜下的硅藻 分离的有丝分裂纺锤体左、微分干涉显微镜；右、相差显微镜；（七）激光共聚焦扫描显微镜（laser laser confocal confocal scanning microscopescanning micro
13、scope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，图像以电信号形式记录。由于激光束的波长较短，光束很细，有效排除焦点以外的光信号干扰，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3 3倍。激光共聚焦扫描显微镜随时采集记录信号，既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。laser confocal scanning microscope,LCSMLCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton(green)and the nucleus(blue)光学
14、显微镜小结普通光学显微镜：0.2um0.2um紫外线显微镜：0.1um0.1um荧光显微镜暗视野显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜激光共聚焦扫描显微镜二、电子显微镜（二、电子显微镜（electron microscopeelectron microscope）简称电镜简称电镜电子显微镜以电子束代替了可见光，大大提高了显微镜的分辨率，可以观察细胞的亚显微结构。电子束的波长与电压成反比，波长极短。例如，电压为6万伏，则=0.0488埃，比最短的可见光4000埃约小10万倍。德国西门子公司制成了第一台电子显微镜，当时分辨率只有3nm3nm。19641964年后达到0.3nm0.3nm，现在最佳性能的电
15、镜分辨本领可达0.1-0.2nm0.1-0.2nm。电镜的基本构造主要如下：A A：电子束照明系统；B B：电磁透镜成像系统；C C：真空系统；D D：记录系统；E E：电源系统。电镜与光镜的主要区别：光光镜镜 电镜电镜 光光 源源 可 见 光 电子束 介介质质 空气（香柏油）真空 聚聚光光镜镜 光学透镜 电磁透镜 分分 辨辨 力力 0.30.30.1um 0.1um 0.1nm0.1nm 放放 大大 倍倍 数数 10001000倍 百万倍 （一）透 射 电 子 显 微 镜（TEMTEM：transmission transmission electron electron microscop
16、e microscope）观察标本内部细微结构放大近百万倍超薄切片（500500埃）通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片采用重金属盐染色，以增大反差。JEM-1011JEM-1011透射电子显微镜细胞毒T T细胞结合到靶细胞（肿瘤细胞）上细胞毒T T细胞杀死了靶细胞 冰冻蚀刻（freeze-etching)freeze-etching)，或冰冻断裂(freeze-fracture)(freeze-fracture)配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。研究生物膜内部结构的有用技术。研究生物膜内部结构
17、的有用技术。主要步骤主要步骤：A.A.冰冻标本（冰冻标本（-100-1000 0C C干冰或干冰或-196-1960 0C C液氮）液氮）B.B.冷刀断开标本（冰冻断裂）冷刀断开标本（冰冻断裂）C.C.升温，冰升华，断裂面结构暴露（蚀刻）升温，冰升华，断裂面结构暴露（蚀刻）D.D.表面喷一层蒸汽碳和铂，表面喷一层蒸汽碳和铂，E.E.将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜（将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜（replicareplica）F.F.电镜下观察复膜，复膜构造电镜下观察复膜，复膜构造=标本构造标本构造蚀刻 复膜（replicareplica）冰冻蚀刻电镜照片 （二）扫描电子显微镜（SEMSEM：sca
18、nning scanning electron microscopeelectron microscope）观察标本表面形态结构标本特殊处理：固定脱水后，喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。JEOLJEOL扫描电子显微镜 人类血细胞SEMSEM照片 弹性纤维网左：狗主动脉的低倍扫描电镜图片；右：同一血管外层的纵向排列的致密弹性纤维网（高放大倍数）。其它成分已用酶和甲酸消化。一个典型的有丝分裂中期的染色体近末端区域的扫描电镜照片一个有丝分裂染色体的染色单体的透射电镜照片一个正在分裂的动物培养细胞，扫描电镜图片早期小鼠胚胎的扫描电镜照片A A：2 2细胞时期B B：4 4
19、细胞时期C C：8-168-16细胞时期，桑椹胚 D D：胚泡期ABCD三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜(scanning tunneling(scanning tunneling microscope,STM)microscope,STM)Binning,RohrerBinning,Rohrer等19811981年发明，获19861986年诺贝尔奖。用来显示晶体表面原子布阵的一种显微镜。原理：加上一定电压的精密探针。钨丝或白金丝，直径几个埃。电子在样品与探针之间（距离几个埃）转移形成电流。特点：分辨率高，横向为0.1-0.2nm，纵向为0.001nm.三维图像。三态物质均可观察。细胞化学
20、和组织化学技术免疫细胞化学显微光谱分析技术放射自显影术超离心技术分子杂交技术PCRPCR技术第二节 生物化学分析一、细胞化学和组织化学技术细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，从而对某种成分进行研究和分析。细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。例：DNADNA的FeulgenFeulgen反应显示法 1924 1924年，Feulgen Feulgen 和RossenbeckRossenbeck发明。原理：盐酸水解，DNADNA分子中的嘌呤碱基被解离，出现醛基，试剂中的无色品红与醛基反应，呈现紫红色，以鉴定DNADNA的存在。例
21、：PASPAS（过碘酸席夫反应）鉴定多糖类物质 醛基与SchiffSchiff试剂反应，生成红色化合物。细胞化学技术细胞化学技术l基于细胞内的某些成分可以和某些化学试剂相结基于细胞内的某些成分可以和某些化学试剂相结合或呈特殊反应，在细胞内或表面形成有色沉淀合或呈特殊反应，在细胞内或表面形成有色沉淀物或结合物而显示细胞的结构和成分。物或结合物而显示细胞的结构和成分。DNADNA的显示：的显示：FeulgenFeulgen反应反应 紫红色紫红色多糖的显示：过碘酸雪夫（多糖的显示：过碘酸雪夫（PASPAS）反应）反应（SchiffSchiff试剂）红色脂类的显示：四氧化锇或苏丹脂类的显示：四氧化锇或
22、苏丹IIIIII酶酶的显示：通常将新鲜标本采用快速冷冻切片，的显示：通常将新鲜标本采用快速冷冻切片，尽可能保持其活性，然后将样品与相应底物进行尽可能保持其活性，然后将样品与相应底物进行共孵育。不同的酶有不同的显示方法。共孵育。不同的酶有不同的显示方法。小鼠肝细胞中糖原人肝癌细胞中的微丝蛋白二、免疫细胞化学（immunocytochemistry)immunocytochemistry)是根据免疫学原理，利用抗体同特异抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是细胞针对特异的抗原分泌的蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或
23、电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。方法：原位分析 体外蛋白质分析（一）原位分析 免疫反应 直接法：Ag+AbAg+Ab*镜检（*代表标记物）间接法：Ag+AbAg+Ab1 1+Ab+Ab2 2*镜检THANK YOUSUCCESS2023/2/463可编辑NSENSE标记神经元GFAPGFAP标记星形胶质细胞（二）体外蛋白质分析蛋白质印迹法（Western blottingWestern blotting）技术路线：样品制备样品分离样品转移免疫反 应检测 蛋白质由SDS聚丙烯凝胶硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹（blottingblotting）三、显微光谱分析技术细胞中有些成分具有特定的吸
24、收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线，如核酸的吸收波长260nm，蛋白质280nm。有些成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。四、流式细胞术仪器：流式细胞仪flow cytometer特点：细胞是高速运动的主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞。五、放射自显影（radioautography)放射自显影技术：利用放射性物质使照相乳胶膜感光，再经显影以显示该物质自身的存在部位的技术。由于有机大分子均含有碳、氢原子，实验室一般采用14C、3H标记。14C、3H均为弱
25、放射性同位素，半衰期长。一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H尿嘧啶核苷显示RNA。在研究蛋白质和粘多糖时，分别选用3H氨基酸、3H甘露糖、3H岩藻糖等。3 3H-H-尿嘧啶脉冲标记的细胞，示异染色质区（核内白色区）无转录活性五、超离心技术高速离心：1000025000r/min1000025000r/min超速离心：转速大于25000r/min25000r/min 沉降系数（“S”Svedberg unit“S”Svedberg unit）:单位离心场中溶质分子的沉降速度,以每单位重力的沉降时间表示，1S 1S 相当于1 11010-13-13s s离心目的：分离细胞器与生物大分子
26、及其复合物离心种类：分析离心：分析离心：用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等制备离心制备离心 ：差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离（介质蔗糖、氯化铯）差速离心（分离细胞器）密度梯度离心蔗糖CsClCsCl六、分子杂交技术（molecular molecular hybridization)hybridization)原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA-DNA,DNA-RNADNA,DNA-RNA或 RNA-RNARNA-RNA杂交的双链分子。方法：原位杂交体外分析核酸的主要方法 South
27、ern blotting Southern blotting又称DNADNA印迹法 Northern blotting Northern blotting又称RNARNA印迹法原位杂交（in situ hybridization)：在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术。染色体在高pH值条件下，DNA解链，带标记的核酸探针即刻与染色体一定部位杂交。既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。人类染色体端粒DNADNA的荧光原位杂交 荧光原位杂交显示的着丝粒DNA（黄）Southern blottingSouthern blotting DNA DNA
28、琼脂糖凝胶电泳转膜探针杂交游离探针洗涤放射自显影 了解基因状态（是否有点突变，扩增重排等）Northern blottingNorthern blotting 是否含有基因的转录产物七、PCRPCR技术：聚合酶链式反应（体外核酸扩增技术）（Polymerase Chain Reaction）原理：将DNA片段经过若干次解链和复性循环，大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知DNA片段进行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析和临床诊断等。一般可扩增106-107。DNA聚合酶：Taq酶，来源于一种嗜热水生菌。最适作用温度75-80度，95度下短时间不失活。模板DNADNA变性：双链DNA
29、DNA解离形成单链模板DNADNA与引物退火：引物与模板DNADNA的单链互补序列配对结合引物延伸：在TaqTaq酶作用下合成一条新的与模板DNADNA链互补的DNADNA链第三节 细胞生理学技术1 1、膜电位检测技术 细胞内外存在电位差（20100mV20100mV）称为膜电位，膜电位的变化反应了细胞的生理变化2 2、膜片钳位记录技术 主要用于检测单个特定离子通道性质及变化3 3、细胞电泳 细胞表面带有许多电荷，因而可以在外加电场的作用下移动第四节实验操作技术一、细胞培养高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动十分困难。活细胞离体培养（一）动物细胞培
30、养20世纪初，Harrison（1907）两栖类胚胎神经管组织悬浮培养，神经细胞存活多天，观察到神经细胞分化成神经元，伸出了轴突。20世纪40年代，W.Earle和R.Dulbecco设计出细胞培养液配方，并将组织分散成单个细胞进行悬浮培养，细胞培养工作广泛展开。体外培养细胞生长特点：贴壁生长（悬浮生长）接触抑制现象细胞消化方法：酶法：胰酶，果胶酶非酶法：EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）细胞培养方式：A.群体培养（mass culture)：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。B.克隆培养(clonal culture)：将高度稀释的游离细胞悬液加入
31、培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生殖生长，每一个细胞形成一个细胞集落，此种集落即称为克隆（clone)。群体培养（左）和克隆培养（右）C.转鼓培养法：使用大容量的原培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁，用于细胞大规模培养而制取细胞产品。化学合成培养基：M-199M-199，RPMI-1640RPMI-1640等细胞培养中要注意：细胞所需要的营养成分要尽量满足 要保持适当的渗透压 严格控制pHpH值 添加细胞所需的生长因子正常组织的初级培养物，细胞传代培养的寿命有一定的限度只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去转化：正常细胞在某种因子的作用下发生
32、突变而成癌性细胞。细胞培养的基本概念外植体:用于体外培养的组织和细胞群。原代培养：直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质。传代培养：将培养细胞从培养器中取出，把一部分移至新的培养器中再进行培养，这种培养方式称为传代培养，亦称为继代培养或连续培养。细胞系：原代培养经首次传代成功后即为 细胞系。细胞株：通过选择从原代培养物或者细胞 系中获得的具有特殊性质或者标 志的细胞。克隆：一个细胞经有丝分裂繁殖的一群后 代。（二）植物细胞培养动物细胞体外不能分化，不能形成组织；植物细胞体外可分化发育为植株，即再生植株。植物细胞培
33、养分为：1.1.花药或花粉培养：花粉 培养液 愈伤组织 分化培养基 长出茎叶 另一分化培养基 根形成 花 盆 植株2.2.胚和胚珠培养：胚 幼胚培养基 2323周 分化胚状体的培养基 长出茎叶3.3.茎顶端培养：茎顶或叶片组织 酶消化 单细胞 愈伤组织途径ABCEDFGIJHK黑麦冬牧70幼穗和未成熟胚愈伤组织诱导及植株再生 ABCDEFGHIJKL黑麦草幼穗离体培养及植株再生 二、显微操作技术在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、胚胎移植以及显微切割等。三、细胞融合概念：真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细
34、胞的过程称为细胞融合（cell fusion)或细胞杂交（cell hybridization)。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon)。同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯、小麦+各种禾本科草等等。单克隆抗体技术是细
35、胞融合技术的成功应用。正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。单克隆抗体技术 四、染色体分析技术（一）核型分析 概念：真核生物中染色体的数量和形态具有物种的特异性。将体细胞核中的全部染色体的显微图像按照大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此图像排列即称为核型(karyotype)或染色体组型。一种蝉（Platypleura kaempferi）的有丝分裂核型核型分析以中期染色体为准。制作过程：首先用
36、秋水仙素抑制纺锤丝的形成，使中期染色体停留在赤道面处；然后用低渗法将细胞胀破，使细胞的染色体铺展到载玻片上；最后将染色体的显微图像裁剪排列即成。美籍华人徐道觉首创。“猫叫综合症”，5号染色体丢失片段（二）染色体分带（chromosome binding)chromosome binding)美籍华人徐道觉首创。利用一定的染色方法可显示出染色体上有一定排列顺序的明暗相间的带，带的排列方式称为带型（bind pattern)，每一染色体均各具有特定的带型。根据带型可鉴别染色体。染色体分带有助于研究基因在染色体上的位置、染色体畸变、基因重排等结构变化，也可在物种间进行染色体比较，为分析进化关系提供依
37、据。不同的染色方法所显示的带型有差异，常用的显带法有三种。1 1、Q-Q-带 用氮芥奎丫因（Quinacrine mustard)或其他荧光染料染色后，在荧光显微镜下染色体的不同区域显示出强弱不同的荧光，这样显示出的带称为Q-带。Q-带主要显示染色体DNA的A-T对丰富区。缺点：由于荧光保持时间短，标本不适于长期保存观察。2 2、G G带标本先用蛋白质水解酶处理，然后用吉姆萨（Giemsa)染液染色而显示出明暗相间的带型，用这种方法显示的带型称为G带。G带显示带型与Q带基本一致，且标本适于长期保存观察，可取代Q带技术。缺点：吉姆萨染色缺乏专一性，可重复性较差。3 3、C C带在染色之前先用Na
38、OH和盐类处理标本，使染色体发生部分变性，但着丝粒区比较稳定。然后用Giemsa染色，染色体两臂的长染色质区仅浅染不显带，而着丝粒区深染，故此染色法只对着丝粒（centromere)显带，特称为C带。C带适用于显示含有高度重复序列的恒定型异染色质（constitutive heterochromosome)区。通过分带技术可使中期染色体显示出若干深染的带，带与带之间的区域为间带（interband)。分带技术为鉴别人类染色体提供了一种新的方法。人类G带核型，G带显示的是染色体上富含AT的区域人类Q带核型，Q带显示的带纹与G带相似 人类C带核型，C带显示的是着丝粒异染色质 THANK YOUSUCCESS2023/2/4126可编辑