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1、重点掌握水溶性维生素的测定（维生素C的测定）的操作知识。了解维生素的概念，各类维生素的性质及生理功能和相关知识第1页/共43页第一食品中的维生素及测定意义一、概念：维生素：指维持人体正常生命活动所必需的一类天然的有机化合物。其种类很多，被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。第2页/共43页二、维生素的特性二、维生素的特性 ：1 1、维生素或其前体化合物都在天然食物中存在；、维生素或其前体化合物都在天然食物中存在；2 2、不不能能供供给给机机体体热热能能，也也不不是是构构
2、成成组组织织的的基基本本原料；原料；3 3、主主要要功功用用是是通通过过作作为为辅辅酶酶的的成成份份调调节节代代谢谢过过程，需要量极小；程，需要量极小；4 4、一一般般在在体体内内不不能能合合成成，或或合合成成量量不不能能满满足足生生理需要，必须经常从食物中摄取；理需要，必须经常从食物中摄取；5 5、长长期期缺缺乏乏任任何何一一种种维维生生素素都都会会导导致致相相应应的的疾疾病病。第3页/共43页三、维生素的种类：三、维生素的种类：1.1.根据其化学性质、结构：根据其化学性质、结构：胺类、醛类、醇类、酚式、醌类等。胺类、醛类、醇类、酚式、醌类等。2.2.根据其物理性质（溶解性）可分为：根据其物
3、理性质（溶解性）可分为：(1)(1)脂脂溶溶性性维维生生素素：维维生生素素A A、维维生生素素D D、维维生生素素K K、维生素、维生素E E。(2)(2)水溶性维生素：维生素水溶性维生素：维生素C C、维生素、维生素B1B1、维、维生素生素B2B2、维生素、维生素B6B6、维生素、维生素P P、维生素、维生素PPPP。第4页/共43页 四、测定维生素的意义四、测定维生素的意义1.1.有助于评价食品的营养价值，开发利用富含有助于评价食品的营养价值，开发利用富含维生素的食品资源维生素的食品资源2.2.指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症乏症3.3.研究
4、维生素在食品加工、贮藏等过程中的稳研究维生素在食品加工、贮藏等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺条件及贮存定性，指导人们制定合理的工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素条件，最大限度地保留各种维生素4.4.监督维生素强化食品的强化剂量监督维生素强化食品的强化剂量 第5页/共43页五、维生素的分析方法五、维生素的分析方法 它们由植物合成并且通常以微量存与植物体中。如果植物组织中的蛋白质，脂肪和碳水化合物的含量是 百分之几，那么维生素的量只能以百分之零点几甚至更小来计算。这就要求对植物中维生素的测定方法既要具有特别高的灵敏度又要有足够的精确度。维生素分析的方法有化学法、仪器法、微生物法和
5、生物鉴定法。第6页/共43页测定方法比较:第7页/共43页二、测定水溶性维生素时的前处二、测定水溶性维生素时的前处理方法理方法 （一）维生素（一）维生素B Bl l、B B2 2通常采用盐通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再将它们从食物中素游离出来，再将它们从食物中提取出来。提取出来。（二）维生素（二）维生素C C通常采用草酸、通常采用草酸、草酸草酸醋酸、偏磷酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液醋酸溶液直接提取。直接提取。第8页/共43页 三、维生素三、维生素C C的测定的测定 （一）概述：（一）概述：1.1
6、.结构及化学性质：结构及化学性质：第9页/共43页2.2.生理功能及在食品工业上应用生理功能及在食品工业上应用(1)(1)参与神经介质、激素的生物合成参与神经介质、激素的生物合成(2)(2)是一种营养添加剂、强化剂、抗氧化剂。是一种营养添加剂、强化剂、抗氧化剂。第10页/共43页测定的方法1.2,6-二氯酚靛酚法2.2,4-二硝基苯肼法3.荧光法法第11页/共43页 （一）（一）2 2，6 6一二氯靛酚滴定法一二氯靛酚滴定法1.1.原理原理 1）还原型Vc能定量地还原2、6-二氯靛酚（染料）2）2、6-二氯靛酚在中性或碱性溶液中显蓝色，在 酸性溶液中显粉红色；被还原后不显色。还原型Vc+染料（
7、显色）氧化型Vc+被还原的染料（不显色）第12页/共43页2.2.仪器仪器(1)(1)组织捣碎机。组织捣碎机。(2)25(2)25mLmL、10mL10mL滴定管。滴定管。(3)100(3)100mlml具塞量简。具塞量简。第13页/共43页 3.3.试剂试剂(1)20(1)20g/Lg/L草酸溶液。草酸溶液。(2)10(2)10g gL L草酸溶液。草酸溶液。(3)(3)淀淀粉粉指指示示剂剂：取取1 1g g可可溶溶性性淀淀粉粉，加加1010mLmL冷冷水水调调成成稀稀粉粉浆浆，倒倒入入正正在在沸沸腾腾的的100100mlml水水中中，搅搅拌拌至透明，放冷备用。至透明，放冷备用。(4)60(
8、4)60g/Lg/L碘化钾溶液。碘化钾溶液。(5)0.1000(5)0.1000molmolLKIOLKIO3 3标标准准溶溶液液：称称取取3.56703.5670g g经经烘干的基准碘酸钾，溶解定容烘干的基准碘酸钾，溶解定容1 1L L。(6)0.00lmol/L KIO(6)0.00lmol/L KIO3 3标准溶液。标准溶液。第14页/共43页式中式中 维生素维生素C C贮备液质量浓度，贮备液质量浓度，mgmgmLmL；V V消耗碘酸钾标准液的体积，消耗碘酸钾标准液的体积，mLmL；0.0880.0881mL0.0010mol/L1mL0.0010mol/L碘酸钾标准液相当碘酸钾标准液相
9、当于于L-L-抗坏血酸的量，抗坏血酸的量，mgmgmLmL。(7)(7)维维生生素素C C标标准准贮贮备备液液；称称取取纯纯L-L-抗抗坏坏血血酸酸粉粉末末2020mgmg，用，用1010g/Lg/L草酸溶解，定容草酸溶解，定容100100mlml。标定：准确吸取上述贮备液标定：准确吸取上述贮备液5.05.0mlml于小锥形瓶中，于小锥形瓶中，加入加入6060g gL L碘化钾碘化钾0.50.5m1m1、淀粉指示剂、淀粉指示剂3 3滴，混滴，混匀后用匀后用0.0010.001mol/Lmol/L标准碘酸钾溶液滴定至蓝色标准碘酸钾溶液滴定至蓝色刚出现为止。刚出现为止。第15页/共43页(8)(8
10、)维维生生素素C C标标准准使使用用液液：准准确确吸吸取取适适量量标标准准维维生生素素C C贮贮备备液液，于于100100mLmL容容量量瓶瓶中中，用用1010g/Lg/L草草酸酸溶液稀释定容，使溶液稀释定容，使1.01.0mLmL含含0.020.02mgmg维生素维生素C C。(9)2,6(9)2,6二二氯氯靛靛酚酚溶溶液液：称称取取5252mgmg碳碳酸酸氢氢钠钠，溶溶解解于于200200mlml沸沸水水中中，然然后后称称取取5050mg2mg2，6 6一一二二氯氯靛靛酚酚，溶溶解解于于上上述述碳碳酸酸氢氢钠钠溶溶液液中中，冷冷却却后后，于于250250mLmL容容量量瓶瓶中中，用用蒸蒸馏
11、馏水水稀稀释释定定容容，过过滤滤于于棕色瓶内，贮存冰箱，每周至少标定棕色瓶内，贮存冰箱，每周至少标定1 1次。次。第16页/共43页标定：准确吸取已知浓度的维生素标定：准确吸取已知浓度的维生素C C标准使用液标准使用液5 5mLmL于小锥形瓶中，加于小锥形瓶中，加5 5ml10g/Lml10g/L草酸溶液，用欲草酸溶液，用欲标定标定 2,6 2,6二氯靛酚溶液滴定至淡红色二氯靛酚溶液滴定至淡红色1515s s不褪，不褪，即为终点，计算出即为终点，计算出1.01.0ml2,6ml2,6二氯靛酚相当于二氯靛酚相当于维生素维生素C C的质量（的质量（mgmg）。）。式式中中 T T每每lmL2,6l
12、mL2,6二二氯氯靛靛酚酚相相当当于于抗抗坏坏血酸的质量，血酸的质量，mgmg；V V1 1维生素维生素C C标准使用液体积，标准使用液体积，mLmL；V V2 2滴定消耗染料的体积，滴定消耗染料的体积，mLmL。第17页/共43页4.4.测定方法测定方法(1)(1)样品制备样品制备 称称取取洗洗净净切切碎碎样样品品5050100100g g（视视维维生生素素含含量量高高低低而而定定）于于组组织织捣捣碎碎机机中中，加加等等量量2020g gL L草草酸酸溶溶液液，打打成成匀匀浆浆。称称取取匀匀浆浆2020g g于于小小烧烧杯杯中中，加加入入适适量量1010g/Lg/L草草酸酸，搅搅匀匀，小小心
13、心移移入入100100mlml具具塞塞量量筒筒中中，用用1010g gL L草草酸酸溶溶液液稀稀释释至至刻度，摇匀，过滤，取中间滤液备用。刻度，摇匀，过滤，取中间滤液备用。(2)(2)滴定滴定 吸吸取取样样品品处处理理滤滤液液1010mLmL，于于5050mlml锥锥形形瓶瓶中中，迅迅速速用用已已标标定定的的2,62,6二二氯氯靛靛酚酚溶溶液液滴滴定定，至至溶溶液液出出现现红红色色1515s s不不褪褪为为终终点点。同同时时做做空空白白试试验。验。第18页/共43页5.5.结果计算结果计算 式中式中 x x还原型维生素还原型维生素C C的含量，的含量，mg/100gmg/100g；T T2,6
14、2,6一一二二氯氯靛靛酚酚相相当当于于维维生生素素C C的的量量，mgmgmLmL；V V滴定时消耗滴定时消耗2,62,6一二氯靛酚的量，一二氯靛酚的量，mLmL；V V0 0滴滴定定空空白白时时消消耗耗2,62,6一一二二氯氯靛靛酚酚的的量量，mLmL；V V1 1样品处理液总体积，样品处理液总体积，mLmL；V V2 2测定用样品处理液体积，测定用样品处理液体积，mLmL；m m称取匀浆相当于原样品的质量，称取匀浆相当于原样品的质量，g g。第19页/共43页6.注意1）靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其它还原性物质（如Fe2+、Sn2+、Cu1+
15、等）会干扰测定，测定结果往往偏高。2为何提取时要用2%的草酸?3）提取时要尽量闭光,避氧气进入，操作要尽量缩短时间,以减少还原型Vc氧化.第20页/共43页2 2，4 4一二硝基苯肼法一二硝基苯肼法（一）一）2 2，4 4一二硝基苯肼的相关知识一二硝基苯肼的相关知识1.1.性质性质2,4-2,4-二硝基苯肼的性状：二硝基苯肼的性状：红色结晶红色结晶性粉末。易溶于苯胺、乙酸酯类，中性粉末。易溶于苯胺、乙酸酯类，中等程度溶于稀无机酸，微溶于乙醇、等程度溶于稀无机酸，微溶于乙醇、水。熔点约水。熔点约200200。熔点熔点198198（分（分解）。溶于无机酸稀溶液、热醇、苯解）。溶于无机酸稀溶液、热醇
16、、苯胺，微溶于水和醇。在酸性中稳定，胺，微溶于水和醇。在酸性中稳定，在碱性中不稳定。在碱性中不稳定。第21页/共43页2.健康危害侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：对眼和皮肤有刺激性。对皮肤有致敏性。本品吸收进入体内后，可引起高铁血红蛋白血症，出现紫绀.3.危险特性：遇明火极易燃烧爆炸。干燥时经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形成爆炸性混合物。燃烧(分解)产物：一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物。第22页/共43页 二、维生素二、维生素c c的性质的性质1.1.易易溶溶于于水水，而而不不溶溶于于苯苯、乙乙醚醚、氯氯仿仿等等大大多多数有机溶剂；数有机溶剂；2.2
17、.在酸性介质中很稳定；在酸性介质中很稳定；3.3.在碱性介质中不稳定，易于分解；在碱性介质中不稳定，易于分解；4.4.易易受受空空气气、光光、热热、酶酶、金金属属离离子子等等的的影影响响，维维生生素素c c对对光光，特特别别是是紫紫外外线线敏敏感感，易易被被光光线线破坏；维生素破坏；维生素C C对氧、铜离子敏感，易被氧化。对氧、铜离子敏感，易被氧化。第23页/共43页二、维生素的特性二、维生素的特性 ：1 1、维生素或其前体化合物都在天然食物中存在；、维生素或其前体化合物都在天然食物中存在；2 2、不不能能供供给给机机体体热热能能，也也不不是是构构成成组组织织的的基基本本原料；原料；3 3、主
18、主要要功功用用是是通通过过作作为为辅辅酶酶的的成成份份调调节节代代谢谢过过程，需要量极小；程，需要量极小；4 4、一一般般在在体体内内不不能能合合成成，或或合合成成量量不不能能满满足足生生理需要，必须经常从食物中摄取；理需要，必须经常从食物中摄取；5 5、长长期期缺缺乏乏任任何何一一种种维维生生素素都都会会导导致致相相应应的的疾疾病。病。第24页/共43页（二）（二）2 2，4 4一二硝基苯肼法一二硝基苯肼法原理原理第25页/共43页（2）试剂）试剂 本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。析纯。4.5mol/L硫酸：谨慎地加硫酸：谨慎地加250mL硫酸（
19、比硫酸（比重重1.84）于）于700mL水中，冷却后用水稀释至水中，冷却后用水稀释至1000mL。85%硫酸：谨慎地加硫酸：谨慎地加90mL硫酸（比重硫酸（比重1.84）于）于100mL水中。水中。2，4 二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液2%：溶解：溶解2g 2，4 二硝基苯肼于二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L硫酸内，过硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。第26页/共43页草酸溶液草酸溶液2%：溶解：溶解20g草酸草酸（H2C2O4）于）于700mL水中，稀释水中，稀释至至1000mL。草酸溶液草酸溶液1%：稀释：稀释500mL2%草酸
20、溶液到草酸溶液到1000mL。硫脲溶液硫脲溶液1%：溶解：溶解5g硫脲于硫脲于500mL1%草酸溶液中。草酸溶液中。硫脲溶液硫脲溶液2%：溶解：溶解10g硫脲于硫脲于500mL1%草酸溶液中。草酸溶液中。第27页/共43页盐酸 1mol/L：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。抗坏血酸标准溶液：溶解100mg纯抗坏血酸于100mL 1%草酸中，配成每毫升相当于1mg抗坏血酸。活性炭：将100g活性炭加到750mL1mol/L盐酸中，回流12h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110烘箱中烘干。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将检验铁离子方法：利用普鲁
21、士蓝反应。将2%亚亚铁氰化钾与铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。（3）仪器和设备）仪器和设备恒温箱：恒温箱：370.5；可见；可见 紫外分光光度计；捣紫外分光光度计；捣碎机。碎机。第28页/共43页3 3操作步骤操作步骤(1)(1)提取提取(2)(2)氧化氧化(3)(3)脎的形成脎的形成 (4)(4)脎的溶解脎的溶解(5)(5)标准曲线的制作标准曲线的制作 第29页/共43页（4）操作步骤）操作步骤样品的制备样品的制备：a、鲜样的制备：称、鲜样的制备：称100g鲜样和鲜样和100g 2%草酸溶液
22、，草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取倒入捣碎机中打成匀浆，取1040g匀浆（含匀浆（含12mg抗坏血酸）倒入抗坏血酸）倒入100mL容量瓶中，用容量瓶中，用1%草酸草酸溶液稀释至刻度，混匀。溶液稀释至刻度，混匀。b、干样制备：称、干样制备：称14g干样（含干样（含12mg抗坏血酸）抗坏血酸）放入乳钵内，加入放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混草酸溶液稀释至刻度，混匀。匀。将上述滤液过滤，滤液备用。不易过滤的样品将上述滤液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。可用离心机沉淀后
23、，倾出上清液，过滤，备用。氧化处理氧化处理：取：取25mL上述滤液，加入上述滤液，加入2g活性炭，活性炭，振摇振摇1 min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入此氧化提取液，加入10mL2%硫脲溶液，混硫脲溶液，混匀。匀。第30页/共43页呈色反应呈色反应：于三个试管中各加入：于三个试管中各加入4mL经氧化的经氧化的试样稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中试样稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入加入1.0mL2%2，4 二硝基苯肼溶液，将所有试二硝基苯肼溶液，将所有试管放入管放入370.5恒温箱或水浴中，保温恒温箱或水浴中，保温3h。3
24、h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中，空白管取出后使其冷到室温。然后加入水中，空白管取出后使其冷到室温。然后加入1.0mL2%2，4 二硝基苯肼溶液，在室温中放置二硝基苯肼溶液，在室温中放置1015min后放入冰水内。其余步骤同样品。后放入冰水内。其余步骤同样品。85%硫酸处理：硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试当试管放入冰水后，向每一试管中加入管中加入5mL85%硫酸，滴加时间至少需要硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置室温放置30min后比色。后比色。比色比色：
25、用：用1cm比色杯，以空白液调零点，于比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。波长测吸光值。第31页/共43页 标准曲线绘制标准曲线绘制：a、加、加2g活性炭于活性炭于50mL标准溶液中，摇动标准溶液中，摇动1 min，过滤。，过滤。b、取、取10mL滤液放入滤液放入500mL容量瓶中，加容量瓶中，加5.0g硫脲，用硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度度20g/mL。c、取、取5mL，10mL，20mL，25mL，40mL，50mL，60mL稀释液，分别放入稀释液，分别放入7个个100mL容量容量瓶中，用瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释
26、硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12g/mL。d、按样品测定步骤形成脎并比色。、按样品测定步骤形成脎并比色。e、以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度、以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（g/mL）为横坐标绘制标准曲线。）为横坐标绘制标准曲线。第32页/共43页（5）结果计算）结果计算式中：式中：X样品中总抗坏血酸含量，样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；c由标准曲线查得或由回归议程算得由标准曲线查得或由回归议程算得“样品氧化液样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，中总抗坏血酸的浓度，g/mL；V试样用试样用1%草酸溶液定容的体积，草
27、酸溶液定容的体积，mL；F样品氧化处理过程中的稀释倍数；样品氧化处理过程中的稀释倍数；m试样质量，试样质量，g。结果的允许差结果的允许差：同一实验室平行或重复测定：同一实验室平行或重复测定 相对相对偏差绝对值偏差绝对值10%。第33页/共43页(ug/ml)第34页/共43页注意事项实验全过程应该避光活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于表面吸附的氧化进行界面，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低：加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，结果也偏低。硫脲的作用在于防止抗坏血酸继续氧化，同时促进脎的生成，溶液中硫脲的浓度要一致，否则会影响测定结果。加入85%硫酸显色后，溶液颜色随时间延长而加深，故加入硫酸
28、后，30分钟后，应准时比色第35页/共43页（四）荧光法1原理：试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。2仪器：荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计；捣碎机。第36页/共43页（2）试剂：）试剂：偏磷酸偏磷酸冰醋酸溶液：称取冰醋酸溶液：称取15g偏磷酸，加入偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀释至冰醋酸，加水稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中；过滤后，贮存于冰箱中；硫酸：硫酸：0.15mol/L偏磷酸偏磷酸乙酸乙酸硫酸溶液：称取硫酸溶液：称取1
29、5g偏磷酸加入偏磷酸加入40mL冰醋酸，用冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀释至硫酸稀释至500mL；乙酸钠溶液称取乙酸钠溶液称取500g乙酸钠溶解并稀释至乙酸钠溶解并稀释至1L；硼酸硼酸乙酸钠溶液：称取硼酸乙酸钠溶液：称取硼酸9g，加入，加入35mL乙酸钠乙酸钠溶液，用水稀释至溶液，用水稀释至1000mL；邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺盐酸盐溶于邻苯二胺盐酸盐溶于100mL水中；水中；抗坏血酸标准溶液：准确称取抗坏血酸标准溶液：准确称取0.500g抗坏血酸溶于抗坏血酸溶于偏磷酸偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸容量瓶中，吸取上述溶液
30、取上述溶液5mL，再用偏磷酸，再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至冰醋酸溶液定容至50mL；第37页/共43页抗坏血酸标准使用溶液：抗坏血酸标准使用溶液：100g/mL百里酚蓝指示剂百里酚蓝指示剂(麝香草酚蓝麝香草酚蓝)：变色范围：变色范围pH1.2(红红)2.8(黄黄)；活性炭：取活性炭：取50g活性炭加入活性炭加入250mL10%盐酸，加热盐酸，加热至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，于中无铁离子为止，于110120烘干。烘干。（3）仪器：荧光分光光度计或具有）仪器：荧光分光光度计或具有350nm及及430nm 波长的荧光计；捣碎机
31、。波长的荧光计；捣碎机。（4）操作步骤：）操作步骤：试样的制备：称取试样的制备：称取100克鲜样克鲜样,加加100mL偏磷酸偏磷酸-乙乙酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，先取少量样品加酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，先取少量样品加入入1滴百里酚蓝，若显红色滴百里酚蓝，若显红色(pH=1.2)，即用偏磷酸，即用偏磷酸冰醋酸溶液定容至冰醋酸溶液定容至100mL；若显黄色；若显黄色(pH=2.8)，即，即用偏磷酸用偏磷酸冰醋酸冰醋酸硫酸溶液定容至硫酸溶液定容至100mL，定容，定容后过滤备用。后过滤备用。第38页/共43页测定：测定：氧化处理：将上述滤液及抗坏血酸标准使用液各氧化处理：将上述滤液及抗坏血酸
32、标准使用液各100ml转入三角瓶中加入转入三角瓶中加入12g活性炭振摇活性炭振摇12分分钟，过滤。即试样氧化液和标准氧化液，待测定。钟，过滤。即试样氧化液和标准氧化液，待测定。各取各取10mL标准氧化液于标准氧化液于2个个100mL容量瓶中，分别容量瓶中，分别标明标明“标准标准”及及“标准空白标准空白”各取各取10mL试样氧化液于试样氧化液于2个个100mL容量瓶中，分别容量瓶中，分别标明标明“试样试样”及及“试样空白试样空白”于于“标准空白标准空白”及及“试样空白试样空白”中各加中各加5mL硼酸硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至，用水稀释至100mL，在，在
33、4冰箱中放置冰箱中放置23小时，即得小时，即得“标准空白标准空白”溶溶液及液及“试样空白试样空白”溶液，备用。溶液，备用。于于“试样试样”及及“标准标准”中各加中各加5mL/L乙酸钠溶液，乙酸钠溶液，用水稀释至用水稀释至100mL,即得即得“试样试样”溶液及溶液及“标准标准”溶液，备用。溶液，备用。第39页/共43页标准曲线的制备：标准曲线的制备：取上述取上述“标准标准”溶液（抗坏血酸含量溶液（抗坏血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和和2.0mL标准系列，取双标准系列，取双份分别置于份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至带盖试管中，再用水补充至2.0mL。取中取中“标准空白标准空
34、白”溶液，溶液，“样品空白样品空白”溶液及中溶液及中“样品样品”溶液各溶液各2mL，分别置于，分别置于10mL带盖试管中。带盖试管中。在暗室迅速向各客中加入在暗室迅速向各客中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应合，在室温下反应35min，于激发光波长，于激发光波长338nm、发、发射光波长射光波长420nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。直线回归方程供计算时使用。第40页/共43页（4）结果计算：）结果计算：式中式中 X-试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c-由标准曲线查得或由回归方程算得试由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，样溶液浓度，g/mL m-试样的质量，试样的质量，g；V-荧光反应所用试样体积，荧光反应所用试样体积，mL；F-试样溶液的稀释倍数。试样溶液的稀释倍数。第41页/共43页谢谢观看！第42页/共43页感谢您的观看！第43页/共43页