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1、病理切片制作技术l第一章第一章 组织的取材和固定方法组织的取材和固定方法 l第二章第二章 组织切片技术组织切片技术 l第三章第三章 苏木精苏木精-伊红染色方法伊红染色方法第一章第一章 组织的取材和固定方法组织的取材和固定方法l病病理理标标本本的的检检查查应应包包括括大大体体和和显显微微镜镜下下观观察察二二个个方方面面，而而正正确确的的诊诊断断往往往往取取决决于于准准确确的的显显微微镜镜下下观观察察，因因此此，制制片片质质量量的的好好坏将直接影响诊断结果的准确性，甚至会带来错误的结果。坏将直接影响诊断结果的准确性，甚至会带来错误的结果。l 近近年年来来，免免疫疫组组织织化化学学方方法法在在病病理
2、理学学上上应应用用越越来来越越广广泛泛，对对取取材材的的要要求求也也越越来来越越高高，不不仅仅要要求求组组织织细细胞胞的的形形态态保保存存完完整整，而而且且要要求求最最大大程程度度的的保保存存组组织织或或细细胞胞成成分分的的抗抗原原性性。抗抗原原性性不不受受损损伤伤是是一一方方面面，还还要要求求不不能能弥弥散散，否否则则，对对于于抗抗原原含含量量较较少少的的标标本本，抗抗原原性性完完全全丧丧失失，产产生生假假阳阳性性结结果果，影影响响病病理理诊诊断断的的准准确确性性，甚甚至抗原的定位也无从谈起。至抗原的定位也无从谈起。第一节第一节第一节第一节 取材取材取材取材 从从大大体体标标本本上上按按照照
3、病病理理检检查查的的目目的的和和要要求求切切取取适适当当大大小小的的组组织块，供制片进行显微镜检查。织块，供制片进行显微镜检查。l一、取材时对送检组织的要求一、取材时对送检组织的要求l二、取材二、取材l三、取材时的注意事项三、取材时的注意事项l四、冰冻切片取材四、冰冻切片取材一、取材时对送检组织的要求一、取材时对送检组织的要求一、取材时对送检组织的要求一、取材时对送检组织的要求l送检组织切取后应立即放入送检组织切取后应立即放入10%10%福尔马林溶液内固定；福尔马林溶液内固定；l尸检标本应争取在死亡后尽可能短的时间内取材；尸检标本应争取在死亡后尽可能短的时间内取材；l有有特特殊殊要要求求（如如
4、细细菌菌培培养养、结结石石的的化化学学成成分分分分析析等等）须须事事先先联联系系，在标本未固定前进行处理。在标本未固定前进行处理。二、取材二、取材二、取材二、取材 对对送送检检组组织织应应进进行行详详细细检检查查，根根据据诊诊断断的的需需要要，确确定定取取材材的的部部位和块数；位和块数；切切取取的的组组织织要要按按不不同同部部位位分分别别给给予予不不同同的的编编号号或或标标记记，以以便便镜镜检时查对。检时查对。三、取材时的注意事项三、取材时的注意事项三、取材时的注意事项三、取材时的注意事项l1 1注注意意防防止止人人为为损损伤伤 切切取取组组织织的的刀刀具具应应锋锋利利、薄薄；切切取取组组织织
5、块块时时，避避免免前前后后拉拉动动或或用力挤压组织，避免使用有齿镊，引起组织结构的变形和损伤。用力挤压组织，避免使用有齿镊，引起组织结构的变形和损伤。l2 2标本大小标本大小 经修整后的组织大小以经修整后的组织大小以1.5 1.5 cm cm 1.5 cm 1.5 cm 0.2-0.3 cm 0.2-0.3 cm 为宜。为宜。l3 3取材时间取材时间 原则上应尽快取材。原则上应尽快取材。l4 4注注意意包包埋埋方方向向 需需指指定定包包埋埋面面的的应应作作记记号号表表明明。如如皮皮肤肤组组织织的的包包埋埋面面应应与与表表面面垂垂直直，才能保证皮肤的各层结构都能被观察到。才能保证皮肤的各层结构都
6、能被观察到。l5 5小小标标本本的的处处理理方方法法 较较小小的的标标本本（如如穿穿刺刺材材料料等等）常常常常用用易易透透水水的的薄薄纸纸包包好好，在在取取材时将标本染上伊红液，以免包埋过程中丢失。材时将标本染上伊红液，以免包埋过程中丢失。l6 6注注意意特特殊殊情情况况 取取材材应应避避免免过过多多的的坏坏死死组组织织或或凝凝血血块块，组组织织块块上上如如有有血血液液、粘粘液液、粪便等污物，应先用水冲洗干净再取材。粪便等污物，应先用水冲洗干净再取材。l7 7取取材材数数量量 不不同同的的标标本本取取材材的的组组织织块块多多少少不不同同，原原则则上上是是凡凡是是可可疑疑处处均均应应取取材材。一
7、一般来讲，除了病变的主体部分外，应注意切取病变组织和正常组织交界处。般来讲，除了病变的主体部分外，应注意切取病变组织和正常组织交界处。l8 8清清除除多多余余部部分分 取取材材时时应应注注意意清清除除组组织织周周围围的的多多余余脂脂肪肪组组织织，否否则则会会对对以以后后的的切切片片和观察带来一定的影响。和观察带来一定的影响。l9 9核对核对 取材完毕，应核对无误，并签署有关信息和记录日期。取材完毕，应核对无误，并签署有关信息和记录日期。l1010组织存放组织存放 取材完毕，标本应按序存放，并加足固定液以备复查。取材完毕，标本应按序存放，并加足固定液以备复查。四、冰冻切片取材四、冰冻切片取材四、
8、冰冻切片取材四、冰冻切片取材（一）取材（一）取材l 在在详详细细检检查查的的基基础础上上选选取取最最有有代代表表性性的的组组织织，必必要要时时应应取取2 2块块或或更更多多组组织织块块。取取材材后后应应立立即即用用液液氮氮速速冻冻，然然后后在在-70-70或或-40-40低低温冰箱保存。温冰箱保存。l（二）注意事项（二）注意事项l 1 1液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨胀破碎。液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨胀破碎。l 2 2新新鲜鲜组组织织不不能能放放入入-10-10冰冰箱箱内内缓缓慢慢冷冷却却，否否则则组组织织内内水水分分可可逐渐析出形成冰晶，造成组织结构破坏。
9、逐渐析出形成冰晶，造成组织结构破坏。l 3 3冷冻后的组织块应密封保存，防止脱水。冷冻后的组织块应密封保存，防止脱水。l 4 4在在组组织织块块复复温温时时，应应在在3737加加温温速速融融，自自然然复复温温将将造造成成组组织织结结构破坏。构破坏。第二节第二节第二节第二节 固定方法固定方法固定方法固定方法 l 将将组组织织浸浸入入某某些些化化学学试试剂剂，使使细细胞胞内内的的物物质质尽尽量量接接近近其其生生活活状状态态时时的的形形态态结结构构和和位位置置，这这一一过过程程称称为为固固定定。凡凡需需病病理检验的各种组织都需经过固定。理检验的各种组织都需经过固定。l一、固定的意义一、固定的意义l二
10、、固定方法的选择二、固定方法的选择l三、固定液三、固定液一、固定的意义一、固定的意义一、固定的意义一、固定的意义 1 1保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。2 2保保持持细细胞胞内内的的特特殊殊成成分分与与生生活活状状态态时时相相仿仿。经经过过固固定定，细细胞胞内内的的一一些些蛋蛋白白质质等等可可沉沉淀淀或或凝凝固固，使使其其定定位位在在细细胞胞内内的的原原有有部部位位，有利于其后物质的确切定位。有利于其后物质的确切定位。3 3便便于于区区别别不不同同组组织织成成分分。组组织织细细胞胞内内的的不不同同物物质质经经固固定定后后产产生生不同的折光
11、率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。4 4有有利利于于切切片片。固固定定剂剂有有硬硬化化作作用用，可可使使细细胞胞正正常常的的半半液液体体状状胶胶体变为半固体状凝胶，使细胞组织硬度增加，便于制片。体变为半固体状凝胶，使细胞组织硬度增加，便于制片。固定剂对组织细胞的不利影响固定剂对组织细胞的不利影响固定剂对组织细胞的不利影响固定剂对组织细胞的不利影响1 1影影响响常常规规染染色色。如如用用福福尔尔马马林林固固定定时时，常常有有福福尔尔马马林林色色素素的的异异常常沉积。沉积。2 2固固定定造造成成物物质质损损失失。不不同同的的固固定
12、定剂剂和和固固定定方方法法会会引引起起不不同同程程度度的的细细胞胞内内蛋蛋白白质质、粘粘多多糖糖、脂脂类类、核核酸酸和和低低分分子子量量物物质质的的损损失失，因因此此应应根根据据研研究究目目的的的的不不同同选选择择适适当当的的固固定定剂剂和和固固定定方方法法，以以使使所所研究的物质损失达到最小。研究的物质损失达到最小。3 3组织皱缩。甲醛、福尔马林固定的组织均有不同程度的皱缩。组织皱缩。甲醛、福尔马林固定的组织均有不同程度的皱缩。二、固定方法的选择二、固定方法的选择二、固定方法的选择二、固定方法的选择l（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系l（二）常用的固定方法（
13、二）常用的固定方法l（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系l 组成细胞的主要成分是蛋白质、脂类和糖类，根据研究目组成细胞的主要成分是蛋白质、脂类和糖类，根据研究目的不同选用不同的固定剂和固定方法，如要保存细胞内糖原用的不同选用不同的固定剂和固定方法，如要保存细胞内糖原用CarnoyCarnoy液固定，液固定，T T淋巴细胞表面抗原为不稳定抗原，极易被固淋巴细胞表面抗原为不稳定抗原，极易被固定液破坏，因此常用冰冻切片进行染色。定液破坏，因此常用冰冻切片进行染色
14、。（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法 1 1蒸蒸汽汽固固定定法法 要要固固定定组组织织中中的的可可溶溶性性物物质质，一一般般选选用用蒸蒸汽汽固固定定法法；较较小小而而薄薄的的标标本本，也也可可用用锇锇酸酸或或甲甲醛醛蒸蒸汽汽固固定定。主主要要用用于于某某些薄膜组织以及血液或细胞涂片的固定。些薄膜组织以及血液或细胞涂片的固定。2 2注注射射、灌灌注注固固定定法法 某某些些组组织织块块体体积积过过大大或或固固定定剂剂难难以以进进入入内内部，或需要对整个脏器或动物进行固定。部，或需要对整个脏器或动物进行固定。3 3细细胞胞涂涂片片的的固固定定方方法法 可
15、可采采用用浸浸入入法法和和滴滴加加法法。用用浸浸入入法法时时，可可将将新新鲜鲜而而湿湿润润的的涂涂片片直直接接浸浸入入固固定定液液内内，如如可可能能，应应每每个个病病例例单独固定以免交叉污染。单独固定以免交叉污染。4 4微微波波固固定定法法 微微波波固固定定的的组组织织具具有有核核膜膜清清晰晰、染染色色质质均均匀匀、组组织织结结构构收收缩缩小小的的优优点点，目目前前已已经经用用于于病病理理诊诊断断。但但应应严严格格控控制制固固定的温度，否则会影响组织固定的质量。定的温度，否则会影响组织固定的质量。（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项1 1固固定定液液
16、的的量量 固固定定组组织织时时，固固定定液液的的量量要要充充足足，一一般般为为组组织织块块总总体体积积的的4-54-5倍倍。而而且且应应在在组织切取后立即或尽快放入适当的固定液中。组织切取后立即或尽快放入适当的固定液中。2 2固固定定液液的的穿穿透透性性 一一般般固固定定液液在在24 24 h h内内不不能能穿穿透透厚厚度度大大于于2-3 2-3 mmmm的的实实体体组组织织或或0.5 0.5 cmcm的的多孔疏松组织。多孔疏松组织。3 3组织块的大小组织块的大小 厚度可根据组织类型而不同，原则上不应超过厚度可根据组织类型而不同，原则上不应超过4 4 mmmm，以以3 3 mmmm更为适宜。更
17、为适宜。4 4固固定定时时间间 大大多多数数组组织织应应固固定定24 24 h h。固固定定的的时时间间与与使使用用固固定定液液的的种种类类、组组织织块块大大小小、温温度度等有关，不同的固定液有不同的固定时间，一般固定时间为等有关，不同的固定液有不同的固定时间，一般固定时间为3-24 3-24 h h。5 5固定温度固定温度 大多数可在室温（大多数可在室温（2525）固定，在低温固定时，固定时间应相应延长。）固定，在低温固定时，固定时间应相应延长。6 6加热加热 加热可使蛋白质凝固，但一般不要求加热，因为加热可加速组织的自溶。加热可使蛋白质凝固，但一般不要求加热，因为加热可加速组织的自溶。7
18、7特特殊殊固固定定 用用于于确确诊诊病病变变，保保证证在在诊诊断断时时特特殊殊结结构构保保存存完完好好。如如尿尿酸酸盐盐结结晶晶就就需需要要特特殊殊固固定。定。三、固定液三、固定液三、固定液三、固定液 用用于于固固定定组组织织的的化化学学物物质质称称为为固固定定液液或或固固定定剂剂，一一般般由由单单一一化化学学物物质质组组成成者者称称为为固固定定剂剂或或单单纯纯固固定定液液；由由多多种种化化学学物物质质混混合合组组成者称为混合固定液或复合固定液。成者称为混合固定液或复合固定液。ll（一）单纯固定液（一）单纯固定液l（二）混合固定液（二）混合固定液（一）单纯固定液（一）单纯固定液（一）单纯固定液
19、（一）单纯固定液l1 1甲醛（甲醛（formaldehydeformaldehyde）l2 2重铬酸钾重铬酸钾 l3 3苦味酸苦味酸 l4 4锇酸（四氧化锇）锇酸（四氧化锇）l5 5丙酮丙酮 l6 6酒精酒精 1 1 1 1甲醛（甲醛（甲醛（甲醛（formaldehydeformaldehydeformaldehydeformaldehyde）市市售售的的为为40%40%的的甲甲醛醛水水溶溶液液，也也称称为为福福尔尔马马林林（formalinformalin）。此此液液久久存存自自行行分分解解，形形成成白白色色沉沉淀淀为为副副醛醛（三三聚聚甲甲醛醛或或多多聚聚甲甲醛醛），可可过过滤滤后后使使用
20、用，但但这这种种溶溶液液中中有有甲甲酸酸产产生生，使使溶溶液液呈呈酸酸性性，影影响响细细胞胞核核的的染染色色，因因此此，储储存存时时间间长长的的甲甲醛醛应应放放入入少少量量碳碳酸酸镁镁或或碳碳酸酸钠钠，或或用用大大理理石石中中和和。在在40%40%甲甲醛醛中中加加入入甲甲醇醇可可阻阻止止聚聚合合作作用用。一一般般作作为为固固定定剂剂使使用的用的10%10%的甲醛，是用水和的甲醛，是用水和40%40%甲醛（甲醛（9:19:1）混合而成，实际上是）混合而成，实际上是4%4%甲醛。甲醛。甲甲醛醛水水溶溶液液渗渗透透能能力力强强，固固定定均均匀匀，组组织织收收缩缩小小，但但经经乙乙醇醇脱脱水水后后收收
21、缩缩较较大大。甲甲醛醛为为非非沉沉淀淀性性固固定定剂剂，不不能能使使白白蛋蛋白白和和核核蛋蛋白白沉沉淀淀。甲甲醛醛通通过过使使蛋蛋白白质质分分子子发发生生交交联联而而产产生生固固定定作作用用。因因其其价价格格较较低低，可可用用于固定和保存大标本。于固定和保存大标本。长时间固定的标本，甲醛氧化产生的蚁酸在组织中与血红蛋白形长时间固定的标本，甲醛氧化产生的蚁酸在组织中与血红蛋白形成棕色的福尔马林色素，在制片前应注意充分流水冲洗，否则可能影成棕色的福尔马林色素，在制片前应注意充分流水冲洗，否则可能影响染色效果。响染色效果。2 2 2 2重铬酸钾重铬酸钾重铬酸钾重铬酸钾 l 常用其常用其1%-3%1%
22、-3%水溶液作为固定剂。未酸化的重铬酸钾不能使水溶液作为固定剂。未酸化的重铬酸钾不能使蛋白质沉淀，但可以使蛋白质变为不溶性，保持其生活时的状态，蛋白质沉淀，但可以使蛋白质变为不溶性，保持其生活时的状态，对于细胞质的固定较好，并且可固定类脂类物质使其不溶于脂溶对于细胞质的固定较好，并且可固定类脂类物质使其不溶于脂溶剂。用于固定高尔基体和线粒体有良好效果，但有溶解染色质的剂。用于固定高尔基体和线粒体有良好效果，但有溶解染色质的缺点，染色质保存相对较差。缺点，染色质保存相对较差。3 3 3 3苦味酸苦味酸苦味酸苦味酸 是是一一种种强强酸酸，易易燃燃易易爆爆。一一般般应应配配成成饱饱和和溶溶液液储储藏
23、藏，常常用用其其饱饱和和溶溶液液作作固固定定剂剂。苦苦味味酸酸能能沉沉淀淀一一切切蛋蛋白白质质，穿穿透透慢慢，组组织织收收缩缩明明显显，但但组组织织没没有有明明显显硬硬化化，可可使使皮皮肤肤软软化化，因因此此皮皮肤肤组组织织用用苦味酸或其混合固定液固定时，易制作完整的切片。苦味酸或其混合固定液固定时，易制作完整的切片。用含苦味酸的固定液固定组织时，时间不宜超过用含苦味酸的固定液固定组织时，时间不宜超过24 24 h h，固定固定后的组织应尽快放入后的组织应尽快放入70%70%的酒精，并在酒精中滴加少量饱和碳酸锂的酒精，并在酒精中滴加少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水，有助于除去苦味酸固定产生的黄色。
24、水溶液或浓氨水，有助于除去苦味酸固定产生的黄色。4 4 4 4锇酸（四氧化锇）锇酸（四氧化锇）锇酸（四氧化锇）锇酸（四氧化锇）为强氧化剂，不能与酒精、甲醛等混合。常用其为强氧化剂，不能与酒精、甲醛等混合。常用其1%-2%1%-2%的水的水溶液作为固定液。是电镜研究必需的固定剂，常用于后固定。锇溶液作为固定液。是电镜研究必需的固定剂，常用于后固定。锇酸的渗透力极弱，易使组织变硬，固定的组织块应小，否则内部酸的渗透力极弱，易使组织变硬，固定的组织块应小，否则内部固定效果不好。但延长固定时间，组织的脆性增加，对染色不利。固定效果不好。但延长固定时间，组织的脆性增加，对染色不利。5 5 5 5丙酮丙酮
25、丙酮丙酮 可与水、醇、氯仿和醚等混合，可使蛋白质沉淀，渗透力强，可与水、醇、氯仿和醚等混合，可使蛋白质沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定（如磷对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定（如磷酸酶、脂酶和氧化酶等）。作用基本与酒精相同。酸酶、脂酶和氧化酶等）。作用基本与酒精相同。6 6 6 6酒精酒精酒精酒精 即乙醇。有固定兼脱水作用，固定速度较慢，易使组织变脆。即乙醇。有固定兼脱水作用，固定速度较慢，易使组织变脆。用于固定的浓度为用于固定的浓度为80%-95%80%-95%。用于糖原的固定，如肝组织等糖原染。用于糖原的固定，如肝组织等糖原染色。酒精的渗透
26、力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋色。酒精的渗透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋白经沉淀后，能溶于水，不利于染色体的固定。高浓度乙醇固定白经沉淀后，能溶于水，不利于染色体的固定。高浓度乙醇固定的组织硬化显著，时间过长组织变脆，收缩明显。酒精一般不作的组织硬化显著，时间过长组织变脆，收缩明显。酒精一般不作常规固定剂，用酒精固定时，常先用常规固定剂，用酒精固定时，常先用80%80%酒精固定数小时，再换酒精固定数小时，再换95%95%酒精继续固定。酒精继续固定。（二）混合固定液（二）混合固定液（二）混合固定液（二）混合固定液1 1B-5B-5固定液固定液 2 2BouinBouin
27、液液 3 3CarnoyCarnoy液液 4 4HellyHelly液液 5 5甲醛甲醛-生理盐水生理盐水 6 6中性缓冲甲醛液中性缓冲甲醛液7 7中性甲醛液中性甲醛液1 1 1 1B-5B-5B-5B-5固定液固定液固定液固定液 即醋酸钠即醋酸钠-升汞升汞-甲醛固定液。多用于固定淋巴组织。用该液甲醛固定液。多用于固定淋巴组织。用该液固定的组织，在染色前应进行脱汞处理。固定的组织，在染色前应进行脱汞处理。2 2 2 2BouinBouinBouinBouin液液液液 常用于活检标本固定的固定液。用于固定大多数组织和器官，常用于活检标本固定的固定液。用于固定大多数组织和器官，适用于结缔组织染色。
28、固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核适用于结缔组织染色。固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核着色鲜明，但细胞质着色较差。对脂肪的固定效果好，尤其适用着色鲜明，但细胞质着色较差。对脂肪的固定效果好，尤其适用于含脂肪的淋巴结、乳腺组织和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸，于含脂肪的淋巴结、乳腺组织和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸，对抗原有一定的损害，使组织收缩，不适宜于标本的长期保存。对抗原有一定的损害，使组织收缩，不适宜于标本的长期保存。固定后组织被染成黄色，需用固定后组织被染成黄色，需用70%-80%70%-80%酒精洗涤。在酒精中加入饱酒精洗涤。在酒精中加入饱和碳酸锂水溶液有助于清除组织块的黄色。和
29、碳酸锂水溶液有助于清除组织块的黄色。3 3 3 3CarnoyCarnoyCarnoyCarnoy液液液液 固定细胞浆和细胞核，对染色体的固定佳，显示固定细胞浆和细胞核，对染色体的固定佳，显示DNADNA和和RNARNA效效果较好。也常用于糖原和尼氏体的固定。不适宜于保存脂类，不果较好。也常用于糖原和尼氏体的固定。不适宜于保存脂类，不适宜于脂肪染色。固定液有防止酒精的硬化和收缩作用，增加渗适宜于脂肪染色。固定液有防止酒精的硬化和收缩作用，增加渗透力，可用作外膜致密不易渗透的组织的固定。该液固定速度快，透力，可用作外膜致密不易渗透的组织的固定。该液固定速度快，3 3 mmmm厚的组织块厚的组织块
30、1 1 h h即可固定，大块材料最好不超过即可固定，大块材料最好不超过4 4 h h。4 4 4 4HellyHellyHellyHelly液液液液 又成为又成为ZenkerZenker福尔马林液。对细胞质固定效果好，显示某些福尔马林液。对细胞质固定效果好，显示某些细胞质内特殊颗粒有独特优越性，对骨髓等造血器官的固定效果细胞质内特殊颗粒有独特优越性，对骨髓等造血器官的固定效果好，对心肌的闰盘保存也有良好效果。好，对心肌的闰盘保存也有良好效果。5 5 5 5甲醛甲醛甲醛甲醛-生理盐水生理盐水生理盐水生理盐水应用最广泛的一种固定液，可保护脂类和细胞核。应用最广泛的一种固定液，可保护脂类和细胞核。6
31、 6 6 6中性缓冲甲醛液中性缓冲甲醛液中性缓冲甲醛液中性缓冲甲醛液 为为免免疫疫组组织织化化学学最最常常用用的的固固定定液液，对对组组织织的的穿穿透透性性好好，组组织织收收缩缩小小。对对大大多多数数抗抗原原物物质质保保存存较较好好，对对细细胞胞膜膜的的通通透透性性有有影影响响，可能使某些大分子抗原失去活性。固定时间以可能使某些大分子抗原失去活性。固定时间以24 24 h h以内为宜。以内为宜。固定液配方：固定液配方：40%40%甲醛甲醛 10 10 mlml，0.01 mol/L PBS 0.01 mol/L PBS（pH 7.4pH 7.4）90 ml90 ml。7 7 7 7中性甲醛液中
32、性甲醛液中性甲醛液中性甲醛液是最常用的固定液之一，固定效果好。是最常用的固定液之一，固定效果好。第二章第二章 组织切片技术组织切片技术在取材后，经固定的标本如组织块较厚则应进行修整。有条在取材后，经固定的标本如组织块较厚则应进行修整。有条件的应根据组织块大小分别进行脱水、透明、浸蜡和包埋，包埋件的应根据组织块大小分别进行脱水、透明、浸蜡和包埋，包埋好的组织块即可按需要进行切片。好的组织块即可按需要进行切片。ll第一节第一节 组织的脱水、透明、浸蜡组织的脱水、透明、浸蜡l第二节第二节 组织的包埋和包埋方法组织的包埋和包埋方法 l第三节第三节 组织切片法组织切片法第一节第一节第一节第一节 组织的脱
33、水、透明、浸蜡组织的脱水、透明、浸蜡组织的脱水、透明、浸蜡组织的脱水、透明、浸蜡l l一、脱水一、脱水一、脱水一、脱水 l l二、透明二、透明二、透明二、透明 l l三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡 l l四、骨和含钙组织脱钙法四、骨和含钙组织脱钙法四、骨和含钙组织脱钙法四、骨和含钙组织脱钙法一、脱水一、脱水一、脱水一、脱水 脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。组织经固定和水脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前必须洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前必须进行脱水。脱水剂必须能与水以任意比例混合，至于选用何种脱
34、进行脱水。脱水剂必须能与水以任意比例混合，至于选用何种脱水剂，应根据固定剂的要求，不要任意选用，否则无法得到满意水剂，应根据固定剂的要求，不要任意选用，否则无法得到满意结果。现将一些常见脱水剂及其性能和注意事项简介如下：结果。现将一些常见脱水剂及其性能和注意事项简介如下：(一一)酒精酒精 (二二)丙酮丙酮 （三）异丙醇（三）异丙醇 （四）正丁醇和叔丁醇（四）正丁醇和叔丁醇 (一一一一)酒精酒精酒精酒精 是是最最常常用用的的脱脱水水剂剂之之一一。它它可可与与水水随随意意混混合合，脱脱水水能能力力较较强强，并并且且可可硬硬化化组组织织。酒酒精精的的穿穿透透速速度度很很快快，对对组组织织有有较较明明
35、显显的的收收缩缩作作用用。为为避避免免组组织织过过度度收收缩缩，在在用用酒酒精精作作为为脱脱水水剂剂时时，应应从从低低浓浓度度开开始始，然然后后再再依依次次增增加加其其浓浓度度。一一般般从从7070酒酒精精开开始始，经经80%80%、9090、9595酒酒精精，尔尔后后至至无无水水酒酒精精。对对于于少少数数柔柔嫩嫩组组织织应应从从5050或或3030酒酒精精开开始始脱脱水水。但但也也应应注注意意，对对于于一一些些需需特特殊殊处处理理的的标标本本，如如进进行行糖糖原原和和尿尿酸酸盐盐结结晶晶染染色色的的标标本本，为为较较好好的的保保存存物物质质的的结结构构（它它们们在在水水中中会会溶溶解解消消失
36、失），应应直直接接用用无无水水酒酒精精固固定定。经经无无水水酒酒精精固固定定的的组组织织，更更换换一一次次无无水水酒酒精精脱脱水水即即可可。一一般般情情况况下下，组组织织经经上上述述处处理理，即即可可达达到到脱脱水水要要求求。但但大大量量组组织织块块同同时时进进行行脱脱水水时时，为为达达到到满满意意的的脱脱水水效效果果，常常经经过过9595酒酒精精和和无无水水酒酒精精各各两两次次。但但注注意意组组织织块块在在纯纯酒酒精精中中放放置置时时间间不不宜宜过过长长，防防止止组组织织过过度度硬硬化化造造成成切切片片困困难难。无无水水酒酒精精经经应应用用后后，很很难难保保证证无无水水，因因此此应应在在无无
37、水水酒酒精精容容器器内内加加人人硫硫酸酸铜铜吸吸收收水水分分。硫硫酸酸铜铜遇遇水水变变蓝蓝后后，即即应应更更换换无无水水硫硫酸酸铜铜或或更更换换纯纯酒酒精精。但但放放人人容容器器的的硫硫酸酸铜铜最最好好不不要要与与组组织织块块接接触触，可可在在硫硫酸酸铜铜表表面面加加一一块块滤滤纸纸。对对于于标标本本量量较较大大的的单单位位，应应经经常常更更换换酒酒精精，对对于于标标本本量量少少，又又不不经经常进行切片的基层单位，可用以上方法。常进行切片的基层单位，可用以上方法。脱脱水水的的时时间间与与组组织织块块大大小小有有关关，对对于于1.5 1.5 cm1.5 cm1.5 cm0.2 cm0.2-0.3
38、 0.3 cmcm的的组组织织块块，一一般般脱脱水时间如下：水时间如下：7070酒酒精精数数分分钟钟，8080、9595、9595、100100、l00l00酒酒精精各各2 2-4 4 h h，将将酒酒精精在在温温箱箱加加温温可缩短脱水时间。可缩短脱水时间。对于小块组织，对于小块组织，8080 -100-100酒精酒精30-45 30-45 minmin即可。即可。但对于结构紧密的组织（如致密结缔组织等）和大块组织则不适用，应根据具体情况进行但对于结构紧密的组织（如致密结缔组织等）和大块组织则不适用，应根据具体情况进行调整。另外，脂肪组织和疏松结缔组织应延长脱水时间，在调整。另外，脂肪组织和疏
39、松结缔组织应延长脱水时间，在9595酒精中水分必须洗净，脂酒精中水分必须洗净，脂肪必须溶解掉。否则石蜡不能渗入脂肪细胞和纤维组织，无法切出好的切片，而且染色时肪必须溶解掉。否则石蜡不能渗入脂肪细胞和纤维组织，无法切出好的切片，而且染色时也容易脱片。这样的组织蜡块，因含有水分，经与空气接触后即干燥出现凹陷。也容易脱片。这样的组织蜡块，因含有水分，经与空气接触后即干燥出现凹陷。(二二二二)丙酮丙酮丙酮丙酮丙丙酮酮的的脱脱水水作作用用与与酒酒精精相相似似，但但对对组组织织块块的的收收缩缩作作用用比比酒酒精精更更严严重重，因因此此一一般般很很少少单单纯纯应应用用丙丙酮酮作作脱脱水水剂剂。在在快快速速脱
40、脱水水或或固固定定兼兼脱脱水水时时有有时时应应用用，脱脱水水时时间间约约l-3 l-3 h h。丙丙酮酮可可作作为为染染色色后后的的脱脱水剂，用于水剂，用于DNADNA和和RNARNA染色。染色。（三）异丙醇（三）异丙醇（三）异丙醇（三）异丙醇 是是酒酒精精的的良良好好代代用用品品，不不含含水水，可可代代替替无无水水酒酒精精使使用用。脱脱水水后后组组织织收收缩缩小小，对对组组织织的的硬硬化化作作用用也也较较弱弱。对对火火棉棉胶胶和和染染料料不不溶溶，因此不能用于火棉胶包埋和染料配制。在常规制片中很少应用。因此不能用于火棉胶包埋和染料配制。在常规制片中很少应用。（四）正丁醇和叔丁醇（四）正丁醇和
41、叔丁醇（四）正丁醇和叔丁醇（四）正丁醇和叔丁醇正正丁丁醇醇是是无无色色液液体体，脱脱水水能能力力较较弱弱，可可和和水水、酒酒精精和和石石蜡蜡混混合合，因因此此这这种种脱脱水水的的组组织织块块可可直直接接浸浸蜡蜡和和包包埋埋。叔叔丁丁醇醇无无毒毒，可可与与水水、酒酒精精、二二甲甲苯苯混混合合。可可单单独独使使用用，也也可可与与酒酒精精混混合合使使用用，是是目目前前常常用用的的一一种种脱脱水水剂剂。与与正正丁丁醇醇相相比比，它它不不易易使使组组织织收收缩缩或或变变硬硬，而而且且脱脱水水后后可可不不经经透透明明直直接接浸浸蜡蜡，浸浸蜡蜡前前先先经经过过叔叔丁丁醇醇和和石蜡石蜡1:11:1混合液。电镜
42、标本制作时常用作中间脱水剂。混合液。电镜标本制作时常用作中间脱水剂。二、透明二、透明二、透明二、透明 为为使使石石蜡蜡能能浸浸人人组组织织块块，组组织织脱脱水水后后，必必须须经经过过一一种种既既能能与与酒酒精精相相混混合合，又又能能溶溶解解石石蜡蜡的的溶溶剂剂，通通过过这这种种溶溶剂剂的的媒媒介介作作用用，而而达达到到石石蜡蜡浸浸入入组组织织块块的的目目的的。在在这这一一过过程程中中，因因组组织织块块中中的的水水分分被被溶溶剂剂（如如二二甲甲苯苯）取取代代，其其折折射射指指数数接接近近于于组组织织蛋蛋白白的的折折光光指指数数，组组织织块块变变得得透透亮亮，因因此此称称之之为为透透明明。组组织织
43、染染色色后后，也也要要进进行行透明。用作透明剂的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮等。透明。用作透明剂的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮等。（一）二甲苯（一）二甲苯 （二）苯和甲苯（二）苯和甲苯 （三）氯仿（三）氯仿（一）二甲苯（一）二甲苯（一）二甲苯（一）二甲苯是是常常用用的的透透明明剂剂，其其折折射射指指数数（refractive refractive indexindex，RIRI）为为1.501.50。它它对对组组织织的的收收缩缩性性强强，易易使使组组织织变变硬硬变变脆脆。因因此此，组组织织块块（3-43-4mmmm）在在二二甲甲苯苯中中一一般般30 30 minmin即即可可使使组组织
44、织透透明明，时时间间不不宜宜过过长长。组组织织块块可可先先经经过过1:11:1无无水水酒酒精精、二二甲甲苯苯混混合合液液处处理理，再再浸浸人人二二甲甲苯苯。切切片片染染色色后后进进行行透透明明，不不会会使使苯苯胺胺染染料料退退色色。如如进进入入二二甲甲苯苯时时出出现浑浊，说明脱水不充分。现浑浊，说明脱水不充分。（二）苯和甲苯（二）苯和甲苯（二）苯和甲苯（二）苯和甲苯苯苯（RI=1.50RI=1.50）和和甲甲苯苯（RIRI1.501.50）与与二二甲甲苯苯的的性性质质相相似似，对对组组织织收收缩缩较较小小，与与二二甲甲苯苯相相比比，不不易易使使组组织织变变脆脆。但但透透明明速速度度慢慢且且挥挥
45、发发快快，吸吸人人苯苯易易引引起起中中毒毒，操操作作应应在在通通风风橱橱或或空空气气较较流流通通处处进进行行。苯苯对对组组织织的的收收缩缩小小，不不引引起起组组织织硬硬化化变变脆脆，适适于于处处理理致致密密结结缔缔组组织织、肌肌肉肉及及腺腺体体等等组组织织的的透透明明。脱脱水水至至无无水水酒酒精精时时即即可可进进入纯苯透明，可长时间停留。甲苯多用于切片染色后的透明。入纯苯透明，可长时间停留。甲苯多用于切片染色后的透明。（三）氯仿（三）氯仿（三）氯仿（三）氯仿氯氯仿仿也也不不易易使使组组织织变变脆脆变变硬硬，但但透透明明能能力力比比二二甲甲苯苯差差，其其RIRI1.451.45，且且极极易易挥挥
46、发发和和易易吸吸收收水水分分，用用作作透透明明剂剂时时，多多用用于于大大块块组组织织（1 1 cmcm）的透明，而且应在容器内放置无水硫酸铜。的透明，而且应在容器内放置无水硫酸铜。总体比较来看，以二甲苯最为常用，而且一般工业用二甲苯总体比较来看，以二甲苯最为常用，而且一般工业用二甲苯即可达到透明效果。用二甲苯透明时，一般经过即可达到透明效果。用二甲苯透明时，一般经过2-32-3次纯二甲苯溶次纯二甲苯溶液，每次液，每次10-1510-15minmin。同时也应根据组织的种类和组织块大小以及液同时也应根据组织的种类和组织块大小以及液体的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。如脑组织和凝血块，应缩体的新鲜
47、程度加以调整，不应机械照搬。如脑组织和凝血块，应缩短在二甲苯内的留置时间。而肌肉组织和胃肠组织则应延长。短在二甲苯内的留置时间。而肌肉组织和胃肠组织则应延长。三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡 组组织织经经透透明明后后，在在熔熔化化的的石石蜡蜡内内浸浸渍渍的的过过程程称称浸浸蜡蜡。为为使使石石蜡蜡充充分分渗渗入入组组织织块块中中，常常需需经经过过2-32-3次次石石蜡蜡浸浸渍渍才才能能完完成成。在在第第一一次次石石蜡蜡中中加加入入少少量量二二甲甲苯苯或或用用低低熔熔点点的的软软蜡蜡，尔尔后后再再浸浸入入高高熔熔点点的的硬蜡效果更好。硬蜡效果更好。一一般般用用于于浸浸蜡蜡的的石石蜡蜡熔熔点点为为5
48、2-5652-56。但但具具体体应应用用时时还还应应考考虑虑当当时时的的情情况况，一一般般在在夏夏天天气气温温较较高高的的情情况况下下，应应采采用用高高熔熔点点的的硬硬蜡蜡，而而在在气气温温较较低低的的季季节节，应应用用低低熔熔点点的的石石蜡蜡，这这样样有有利利于于切切片片制制作作。组组织织块块总总的的浸浸蜡蜡时时间间约约3-4 3-4 h h。当当然然也也应应根根据据组组织织块块的的种种类类和和大大小小以以及及温温度度情情况况加加以以灵灵活活掌掌握握。时时间间不不宜宜过过长长，否否则则易易造造成成组织块脆硬，时间不足，也难制作良好的切片。组织块脆硬，时间不足，也难制作良好的切片。对于一般的动
49、物组织，脱水、透明和浸蜡时间如下：对于一般的动物组织，脱水、透明和浸蜡时间如下：7575酒精酒精 长短不定长短不定 8585酒精酒精 120-300 120-300 min min 95 95酒精酒精I I和和 II 120-300 minII 120-300 min ll ll 无水酒精无水酒精I I、II II 和和 III 30 min III 30 min 无水酒精无水酒精 III 60-120 minIII 60-120 min 二甲苯二甲苯I I和和 II 30 minII 30 min 二甲苯二甲苯III 60 minIII 60 min 56-58 56-58石蜡石蜡 30 3
50、0 minmin 56-58 56-58石蜡石蜡 60-120 60-120 minmin 56-58 56-58石蜡石蜡 120-180 120-180 minmin四、骨和含钙组织脱钙法四、骨和含钙组织脱钙法四、骨和含钙组织脱钙法四、骨和含钙组织脱钙法 骨骨、牙牙齿齿和和有有钙钙化化的的组组织织在在充充分分固固定定后后，应应进进行行脱脱钙钙处处理理。脱脱钙钙组组织织的的厚厚度度不不宜宜超超过过4 4 mmmm。牙牙齿齿和和骨骨可可先先锯锯开开，而而后后用用砂砂轮轮磨磨成成薄薄片片脱脱钙钙，有有钙钙化化的的组组织织再再经经脱脱钙钙液液浸浸泡泡短短时时即即可可。组组织织脱脱钙有多种方法，常用的