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1、第1页/共26页1.Bt杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis，Bt)Bt)所产生的毒素。毒蛋白主要有7 7种：A2A2外毒素、B2B2外毒素、C2C2外毒素、-内毒素、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子外毒素。-内毒素是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶体，位于芽孢之旁，所以又称伴孢晶体毒素，是主要的杀虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素(Pretoxin)(Pretoxin)，经过激活，即消化成分子量为10001000700007
2、0000的片段，才起毒素作用。第2页/共26页 晶体蛋白有130130多种，按照杀虫范围和寄主同源型又可分为两大类群，即CryCry 蛋白和CytCyt蛋白。CryCry在活体和离体条件下只对鳞翅目、双翅目或鞘翅目有效；CytCyt活体条件下只对双翅目有效，而离体条件下具有广谱性。CryCry分为四大类（根据杀虫谱）：CryCryI I（鳞翅目）、CryCryII(II(鳞翅目和双翅目)、CryCryIIIIII（鞘翅目）和CryCryIV(IV(双翅目)。通常一种毒素只能杀死某一目的部分易感昆虫，对有益生物和脊椎动物安全。1.Bt杀虫晶体蛋白（ICPs）第3页/共26页 完整的毒蛋白一般由三
3、个结构域组成。结构域由一个-螺旋束组成，可能与细胞膜穿孔有关；结构域由三组-折叠片层组成，可能参与了毒素与膜受体蛋白的识别和结合；结构域位于毒素分子C-C-端，则可能能够防止昆虫肠道蛋白酶对毒性肽分子的进一步降解。1.Bt杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）第4页/共26页第5页/共26页2.Bt毒素受体蛋白 晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白结合的能力呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白专一性的决定因子。昆虫中肠BtBt毒素受体蛋白主要为存在中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV)(BBMV)的氨肽酶N N (aminopeptidase N(aminopepti
4、dase N，APN)APN)（肽链端解酶，催化蛋白氨基末端残基的分裂 ）。鳞翅目。烟草天蛾中肠BBMVBBMV上CryCry1Ab1Ab毒素的受体BT-R1BT-R1，证明它是一种类钙粘蛋白(cadherin-like)(cadherin-like)。尖音库蚊幼虫中肠中球形芽孢杆菌晶体的BinBin毒素受体可能是一种-葡糖苷酶。第6页/共26页 -内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入、孔洞或离子通道形成等五个环节。昆虫取食孢子和毒素毒素被蛋白酶活化毒素与膜受体结合毒素造成膜穿孔使细胞裂解3.3.杀虫晶体蛋白的作用机理第7页/共26页 毒素的溶解毒素的溶解 晶体蛋白可以溶解于p
5、H 12pH 12或pH 9.5pH 9.5并加有巯基试剂的碱性溶液中。中肠内环境诸如pHpH值、还原电势、去垢性、体积等都可能影响-内毒素在昆虫体内的溶解性。鳞翅目幼虫的中肠pHpH值一般都较高，呈碱性,对-内毒素的溶解很有利。3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 第8页/共26页 毒素的活化毒素的活化 溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由130kD130kD左右的前毒素，打开二硫键，释放出N N 端的70kD70kD左右的抗酶多肽活力片段。活力片段至少由两部分组成,即毒力片段和细胞结合片段。毒力片段位于N N端,由几个保守的亲水区组成，主要结构是-螺旋，对于跨膜通道的形成及毒效可能起着重要作用。细
6、胞结合片段由C C端的保守区和中间的可变区组成，主要结构是-片层，负责毒素与靶标昆虫受体的结合，从而决定了毒素的选择性。中肠酶液的组成直接影响到-内毒素的降解活化,对-内毒素作用的专一性起着重要作用。3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 第9页/共26页毒蛋白的活化过程被昆虫取食的晶体蛋白在中肠被溶解碱性环境成熟毒素被中肠蛋白酶消化活化毒素的活化毒素的活化 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 第10页/共26页3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 毒素与受体蛋白的结合毒素与受体蛋白的结合 毒素被活化以后，毒素首先是通过结构域与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结合。结合分为两步，第一步即初始结合(Initial
7、(Initial Binding)Binding)，结合上的毒素可以再次与受体发生解离，故又称可逆性结合(Reversible(Reversible Binding)Binding)；初始结合之后，毒素进一步与膜受体蛋白发生紧密结合或直接插入细胞膜,此时的毒素与受体难以发生解离,故为不可逆性结合(Irreversible Binding)(Irreversible Binding)。第11页/共26页 插插入入及及孔孔洞洞或或离离子子通通道道的的形形成成 活化的毒素与刷状缘膜上的受体结合后，结构域插入膜内，形成孔洞或离子通道，导致膜完整性的破坏，引起离子渗漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、
8、死亡。3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 第12页/共26页(+)结构域 I-螺旋束 第13页/共26页3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域结构域在杀虫蛋白中的作用在杀虫蛋白中的作用 CryCry蛋白的结构域是由6-76-7个两亲的-螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋形成的。定点突变结果表明,结构域可能是通过自身的带正电荷残基与带负电荷的膜表面接触的。对于结构域在膜上形成穿孔的机制，认为是结构域IIII在完成毒素-受体识别后，结构域受毒素-受体结合的诱导要发生重大构象变化，周围的两亲-螺旋向外翻，由-4-4螺旋与-5-5螺旋构成的“轴”突出，4 4个毒素分子的-5-5螺旋相互靠近形成孔道的内壁，而4
9、4个-4-4螺旋则形成孔道的外壁，孔道穿透整个磷脂双层，细胞外的水大量内流，导致细胞胀裂。第14页/共26页-5螺旋-4螺旋-5螺旋细胞膜-4螺旋细胞膜图2 Bt杀虫毒蛋白作用的伞型模型与形成孔道原理示意图H2O第15页/共26页3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域由3 3个-折叠片层组成，主要进行毒素与受体蛋白的特异性识别。在每个片层的顶端各有一个突环。毒素与受体的作用主要是通过这些突环与受体蛋白识别、并进一步不可逆结合的。突环上氨基酸组成和残基的带电性、侧链大小及疏水性等对毒素与受体的专一性结合都有影响，删除突环或改变突环上残基的性质都会导致毒素与受体结合能力的严重丧失。结构域II-片层
10、上的突环结构域结构域在毒素在毒素-受体结合中的作用受体结合中的作用第16页/共26页3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域结构域在毒素在毒素-受体结合中的作用受体结合中的作用 结构域是由两组反平行的-折叠片层组成的三明治结构。通过交换不同毒素的结构域发现,该结构域对毒素的杀虫专一性有一定影响。结构域也参与了毒素与受体的结合。结构域与受体结合及离子通道活性的调节有关。第17页/共26页 不同品系的BtBt由于产生的CryCry蛋白类型不同，不仅杀虫谱不同，而且很可能拥有不同的作用方式。总之，BtBt内毒素在进入昆虫中肠后，先是在碱性条件下溶解，然后被活化为小分子多肽,再与中肠内膜上的刷缘状膜小泡
11、（BBMVBBMV）中特异受体结合，毒素分子插入质膜形成一个微孔，阳离子和小分子渗入，这些微孔因渗透肿胀而变大，最终细胞破裂。昆虫中肠上皮细胞死亡，肠壁受损，肠道内容物进入血淋巴，直接造成血淋巴pHpH值上升可使昆虫麻痹死亡；毒性肽进入血淋巴可使昆虫患毒血症死亡；活细胞或孢子进入血腔可使昆虫患败血症死亡。3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 第18页/共26页第19页/共26页二氢沉香呋喃类化合物：苦皮藤素、等可致粘虫：中肠柱状细胞的微绒毛排列不整齐，大量脱落；基膜内褶空间变大，排列紊乱；细胞质密度降低；内质网极度扩张，囊泡化，核糖体脱落；线粒体嵴模糊不清楚，双层膜不完整。推测其机理为：此类化合物与
12、昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞肿胀、失水、瓦解，最终死亡。推测其机理为：此类化合物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞肿胀、失水、瓦解，最终死亡。二、其他消化毒剂第20页/共26页饥饿对照处 理正常对照脱氧鬼臼毒素对菜青虫组织结构的影响浑浊溃烂状肠道内无食物残渣，呈黄色透明鬼臼毒素类化合物 第21页/共26页CK12h24h72h48h36h组织学观察结果：中肠围食膜逐渐消融，几乎完全消失。第22页/共26页对照试虫中肠饥饿试虫中肠处理试虫中肠CK中肠完好,厚度较均匀，细胞间隙小，而处理
13、中肠肠壁细胞逐渐变得浑浊不连续，且中肠细胞松散，细胞间隙拉大，中肠肠壁细胞间的气泡明显增多。这可能是由于脱氧鬼臼毒素作用于试虫的肠壁细胞，肠壁细胞被破坏，肠壁细胞外液得以内渗，导致肠壁细胞肿胀。组织学观察结果第23页/共26页处理中肠微绒毛对照中肠微绒毛组织学观察结果：第24页/共26页丁布：可阻碍欧洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟幼虫的发育，使得幼虫体重降低，发育迟缓，蛹重降低，并出现畸形蛹等，并对亚洲玉米螟幼虫具有较强的拒食作用。丁布是一种消化抑制剂，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性而影响食物的消化，进而影响昆虫的生长发育。丁布作用于玉米螟的中肠细胞，使肠壁细胞再生细胞大量分裂，打破了固有的分裂周期，造成局部肿瘤，进而细胞消融。急剧增长的肿瘤细胞消耗大量的能量，而且受损的肠壁细胞不再具备分泌消化酶进行消化和吸收营养物质的功能，因而造成幼虫缺乏营养而死亡。第25页/共26页感谢您的观看！第26页/共26页