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1、1 1、掌握动物组织总、掌握动物组织总DNADNA的提取方法及其原理。的提取方法及其原理。2 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。法。3 3、学习核酸染色的方法。、学习核酸染色的方法。一、实验目的：第1页/共30页二、实验原理:要获得纯的要获得纯的DNADNA样品，必须考虑以下几点：样品，必须考虑以下几点：如何选材，如何破碎组织细胞？如何选材，如何破碎组织细胞？如何除去蛋白质？如何除去蛋白质？(在真核细胞内，在真核细胞内，DNADNA与蛋白质结合成与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离核蛋白的形式存在。因此，分离DNADNA时必须使其与蛋白质解
2、离，时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。并除去蛋白质。)设法除去设法除去RNARNA的污染；的污染；防止防止DNADNA酶的降解作用；酶的降解作用；（一）动物肝脏DNA制备原理第2页/共30页选材 要提取动物组织要提取动物组织DNADNA，一般选择细，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。第3页/共30页研磨：研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验
3、室使用。室使用。组织捣碎器：组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转升温过高，通常是转1010秒秒2020秒，停秒，停1010秒秒2020秒，可反复秒，可反复多次。多次。压榨法：压榨法：在在1000101000105 5Pa200010Pa2000105 5Pa Pa 的高压下使几十的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。细胞破碎方法机械物理法：第4页/
4、共30页反复冻融法：反复冻融法：将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至1515到到2020，然后放于室温，然后放于室温(或或40)40)迅速融化，由于细迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。胞溶胀破碎。超声波处理法：超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。和细胞器。使用时注意降温，防止过热。冷热交替法：冷热交替法：在在9090左右维持数分钟，立即放入左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可
5、以被破碎。可以被破碎。细胞破碎方法机械物理法第5页/共30页有机溶剂处理法：有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或或SDSSDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。可以与研磨法联合使用。溶胀法：溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内分子大量进入细胞，将细胞膜胀破
6、释放出细胞内含物。含物。细胞破碎方法化学方法第6页/共30页(三)除去RNA的方法 脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白在浓在浓NaClNaCl（1-2mol1-2molL L）溶）溶液中溶解度很大，但在液中溶解度很大，但在L NaClL NaCl溶液中溶解度很低，溶液中溶解度很低，而而核糖核蛋白核糖核蛋白则溶于则溶于L NaClL NaCl溶液中，利用这一溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。离开来。第7页/共30页(四)除去蛋白质的方法用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋
7、白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而氯仿相中间，而DNADNA溶于上层水相。用两倍体积溶于上层水相。用两倍体积 9595乙乙醇溶液可将醇溶液可将DNADNA钠盐沉淀出来。钠盐沉淀出来。用十二烷基硫酸钠（用十二烷基硫酸钠（SDSSDS）等去污剂使蛋白质变性，可以）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取直接从生物材料中提取DNADNA。第8页/共30页纯的DNA样品的获得为了防止为了防止DNADNA酶的降解，提取时可加入适量酶的降解，提取时可加入适量EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低（乙二
8、胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNADNA酶的活性。酶的活性。加入加入RNARNA酶降解剩余的酶降解剩余的RNARNA，获得纯的，获得纯的DNADNA。保保存存：将将DNADNA于于滤滤纸纸上上干干燥燥，溶溶于于1mlTE1mlTE中中低温保存。低温保存。第9页/共30页（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：l琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。l琼脂糖琼脂糖英文名agarose，是从琼脂琼脂中提取出来的，由半半乳糖乳糖和L-L-半乳糖半乳糖相互结合的链状多糖链状多糖。琼脂糖和琼脂
9、琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用电渗作用降低，因而分离效果明显提高。第10页/共30页lDNADNA分子分子在在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（中向正极移动（电荷效应电荷效应）。lDNA分子泳动速率的大小除与分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关分子的带电量有关外，还与外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的的分子筛效应分子筛效应）。）。l电泳时，用电泳时，用溴酚蓝
10、溴酚蓝做前沿指示剂，用做前沿指示剂，用溴化乙啶溴化乙啶（ethidium bromide，EB）指示指示DNA样品在凝胶中的样品在凝胶中的确切位置。确切位置。l溴化乙啶溴化乙啶是一种荧光染料，可插入是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的双螺旋结构的两个碱基对之间，与两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。激发下发出橙黄色的荧光。第11页/共30页l荧光荧光来自两方面，一是核酸吸收来自两方面，一是核酸吸收260260nmnm的紫外光，的紫外光，并将能量传给并将能量传给EB；二是二是EB本身吸收波长为本身吸收波长为302302nmnm和
11、和360360nmnm的紫外光。这两方面的能量最终激发的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为发出波长为590590nmnm的红橙色荧光。的红橙色荧光。l溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含胶放在含EB的溶液中浸泡的溶液中浸泡.l溴化乙啶检测溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的甚至更少的DNA。第12页/共30页琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系凝胶中，凝胶中，DNA片段迁移率与片段迁移率与DNA分子大小分子大小(碱基对的对数碱基对的对数)成成反比反比(2
12、0kb)，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型不同构型DNA的移动速度次序为：闭环的移动速度次序为：闭环DNA直线直线DNA开环开环的双链环状的双链环状DNA.（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度琼脂糖浓度/%/%0.30.60.70.91.21.52.0线状线状DNADNA大小大小/kbkb60-520-110-0.87-0.56-0.43-0.22-0.1注：注：DNA
13、DNA片段在片段在5-5005-500bpbp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）进行电泳分离。进行电泳分离。第13页/共30页琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：（1 1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离快、分离DNADNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。（2 2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。高，重复性好。（3 3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳
14、过程和结果可直接用紫外）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。光检测及定量测定。（4 4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。成干膜可长期保存。因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一，中常用实验方法之一，DNADNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。第14页/共30页 荧光染料EB染色后，在紫外灯(305nm)下观察到的
15、电泳结果：第15页/共30页 *荧光染料荧光染料EBEB染色的原理和优点是什么？染色的原理和优点是什么？1 1、原理：、原理：EBEB：即即3,8-3,8-二二氨氨基基-5-5-乙乙基基-6-6-苯苯基基菲菲锭锭溴溴盐盐(Ethidium Ethidium Bromide)Bromide)。EBEB是是一一种种扁扁平平分分子子，它它可可以以嵌嵌入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。激激发发的的荧荧光光的的能能量量来来源源于于两两个个方方面面：一一是是核核酸酸吸吸收收2 260nm60nm的的紫紫外外线线后后将将能能量量传传递递给给E
16、BEB，二二是是EBEB本本身身吸吸收收302302nmnm和和360360nmnm的的紫紫外外线线的的能能量量。这这两两方方面面的的能能量量最最终终激激发发EBEB发射波长为发射波长为590590nmnm的可见光（红橙区）。的可见光（红橙区）。第16页/共30页 2 2、优点：、优点：（1 1）染色比较简便、快捷，一般在）染色比较简便、快捷，一般在10101515minmin就可反应。就可反应。（2 2）EBEB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB灵敏度高，可检测出灵敏度高，可检测出1010ngng或更少的或更少
17、的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的检测。的检测。（5 5）EBEB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。灯检测电泳的进程和效果。（6 6）EB-DNAEB-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的荧光比游离的发出的荧光比游离的EBEB强强1010倍，倍，因此不需洗净凝胶中游离的因此不需洗净凝胶中游离的EBEB也可检测出也可检测出DNADNA的条带。的条带。第17页/共30页3 3、缺点：、缺点：溴溴化化乙乙啶啶是是一一种种强强的的致致突突变变剂剂，在在操操作作和
18、和配配制制试试剂剂时时应应戴戴手手套套。含含溴溴化化乙乙啶啶的的溶溶液液不不能能直直接接倒倒入入下下水水道道，应应进行处理。进行处理。（1 1）每）每100100mlml溶液中加入溶液中加入100100mgmg粉状活性炭；粉状活性炭；（2 2）室温下放置）室温下放置1 1小时，不时的摇动；小时，不时的摇动；（3 3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；（4 4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。*溴溴化化乙乙啶啶在在260260分分解解，在在标标准准条条件件下下进进行行焚焚化化后后不不会会有有危危险性。险性。第18页
19、/共30页(一)材料：动物肝脏(二)试剂：（1）0.14molLNaCl0.15molLEDTA-Na溶液：（2）20SDS溶液：（3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液：（4）95乙醇溶液。（5）80乙醇溶液。（6）缓冲液：10mmolLTrisHCI，lmmolLEDTANa，其中含RNA酶20ugmL。二、实验材料、试剂和仪器:第19页/共30页（7）电泳缓冲液：Tris-硼酸EDTA（50TBE）pH8.0。（8）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。（9）溴化乙啶（EB）溶液：10g/ml。（10）琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。(三)仪器（1）稳压稳流电泳仪（2）可调微量移液器
20、（3）水平电泳槽（4）暗箱紫外透射仪等。第20页/共30页移液器的使用自动取液器的构造自动取液器的使用吸入液体 排出液体使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。第21页/共30页三、实验步骤：1 1取新鲜动物肝，称取取新鲜动物肝，称取2 2g g，切成小块，加入切成小块，加入4 4ml 0.14molml 0.14molL NaClL NaCl0.15mol0.15molL EDTAL EDTA溶液，于研钵溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加中研磨至匀浆，再加4 4mlml清洗转入离心管中清洗转入离心管中，以以40004
21、000r rminmin的转速离心的转速离心 10 10minmin。第22页/共30页2 2在上述沉淀物中加入在上述沉淀物中加入4 4mLmolmLmolL NaClL NaCl0.15mol0.15molL EDTAL EDTA溶液，然后在溶液，然后在6060下，滴加下，滴加 2020SDSSDS溶液溶液3 35 5滴滴，边加边摇动，再摇动边加边摇动，再摇动 1010minmin，使核酸与蛋白质分离。使核酸与蛋白质分离。3.3.g g混混匀匀，使使其其最最终终浓浓度度达达到到l.4moll.4molL L，水水浴浴3030minmin。第23页/共30页 4 4加等体积的氯仿一异戊醇，混匀
22、，摇动加等体积的氯仿一异戊醇，混匀，摇动5 5minmin，以，以40004000r rminmin的转速离心的转速离心1010minmin。离心管内离心管内的物质分为三层，上层为含的物质分为三层，上层为含DNADNA的水相层，下层为氯的水相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。第24页/共30页5 5吸出上清液，加入吸出上清液，加入2 2倍体积倍体积9595乙醇溶液乙醇溶液（预冷），产生沉淀。（预冷），产生沉淀。6.6.再再以以40004000r rminmin的的转转速速离离心心溶溶液液1010minmin，弃弃去上清液去上清液(沉淀用
23、沉淀用8080乙醇溶液离心洗涤乙醇溶液离心洗涤)。7 7将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入然干燥后，加入200200ul ul 电极缓冲液电极缓冲液，使使DNADNA充分充分溶解，待用。溶解，待用。第25页/共30页8.8.凝胶板的制备：凝胶板的制备：（1 1）取琼脂糖0.7 0.7 g g，加11TBETBE缓冲溶液100100mlml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%0.7%的琼脂糖胶液。（2 2）胶床两头贴上防水胶带，形成8 8mmmm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。（3 3）插入梳子，梳齿下端离板底0.50.51 1mmmm。（4 4
24、）g/mLg/mL的EBEB溶液。（5 5）将6060凝胶不间断倒入胶床，高3 34 4mmmm，避免气泡，摇匀，室温下凝固。（6 6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1 12 2mmmm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。第26页/共30页9.9.加样：加样：将将样样品品DNADNA溶溶液液与与加加样样缓缓冲冲液液以以5 5：1 1的的体体积积比比混混合合，用用微微量量移移液液器器加加样样，每每加加完完一一个个样样品品，冲冲洗洗三三次次。加加样样量量151520 20 l l（加加样样时时应应防防止止碰碰坏坏样样品品孔孔周周围围的的凝凝胶胶面面以以及及穿穿透透
25、凝凝胶底部）。胶底部）。10.10.电泳：电泳：为为了了获获得得电电泳泳分分离离DNADNA片片段段的的最最大大分分辨辨率率，电电场场强强度度不不应应高高于于5 5V/cmV/cm（两两电电极极间间的的距距离离）开开始始时时用用较较高高电电压压(80(80V)V)，样样品品一一进进入入胶胶内内则则将将电电压压调调至至5 5V/cm V/cm。当当染染料料前前沿沿移移至至底底边边1-21-2mmmm时，电泳毕。时，电泳毕。11.11.观察观察 关关闭闭电电源源，取取出出胶胶床床，在在紫紫外外检检测测仪仪下下观观察察凝凝胶胶中中的的DNADNA（红橙色荧光）。红橙色荧光）。第27页/共30页五、思考题：五、思考题：1 1、用用荧荧光光染染料料EBEB染染色色的的原原理理和和优优缺缺点是什么？点是什么？2 2、绘制、绘制DNADNA电泳图谱。电泳图谱。第28页/共30页核酸提取过程中的注意事项：核酸提取过程中的注意事项：（1 1）避免过酸过碱或高温环境，合适的T T：0 044，pH4-9 pH4-9；（2 2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；（3 3）防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂EDTAEDTA，柠檬酸钠；（4 4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。第29页/共30页感谢您的观看！第30页/共30页