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1、实 验 五,动物肝脏中DNA的制备和鉴定,学时：6 2007.4.27,1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。 3、学习核酸染色的方法。,一、实验目的：,二、实验原理:,要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： 如何选材，如何破碎组织细胞？ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。) 设法除去RNA的污染； 防止DNA酶的降解作用；,（一）动物肝脏DNA制备原理,选 材,要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等
2、。,研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。 组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒20秒，停10秒20秒，可反复多次。 压榨法：在1000105Pa2000105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。,细胞破碎方法机械物理法：,反复冻融法：将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细
3、胞器。使用时注意降温，防止过热。 冷热交替法：在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。,细胞破碎方法机械物理法,有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。,细胞破碎方法化学方法,(三)除去RNA的方法,脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2molL）溶液中溶解度很大，但在0.14molL NaCl溶液中溶解度很低，而
4、核糖核蛋白则溶于0.14molL NaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。,(四)除去蛋白质的方法,用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。,纯的DNA样品的获得,为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。 保存：将DNA于滤纸上干燥，溶
5、于1mlTE中低温保存。,（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。,DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还与D
6、NA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。,荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。 溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡. 溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10n
7、g甚至更少的DNA。,琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素,（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比( 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA. （3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-
8、0.2 2-0.1注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。,琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：,（1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。（2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳
9、。,荧光染料EB染色后，在紫外灯(305nm)下观察到的电泳结果：,* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？ 1、原理： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。 激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收260nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。,2、优点： （1）染色比较简便、快捷，一般在1015min就可反应。 （2）EB对核酸分子无破坏作用，这
10、是其它染料所不能做 到的。 （3）EB灵敏度高，可检测出10ng或更少的DNA含量。 （4）既可用于DNA也可用于RNA的检测。 （5）EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。 （6）EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍， 因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。,3、缺点： 溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。 （1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭； （2）室温下放置1小时，不时的摇动； （3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液； （4）用塑料袋封装滤纸和活
11、性炭，作为有害废物处理。 *溴化乙啶在260分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。,(一)材料：动物肝脏 (二)试剂： （1）0.14molLNaCl0.15molL EDTA-Na溶液： （2）20SDS溶液： （3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液： （4）95乙醇溶液。 （5）80乙醇溶液。 （6） pH8.0TE缓冲液：10 mmolLTrisHCI，lmmolL EDTANa，其中含RNA酶20ugmL。,二、实验材料、试剂和仪器:,（7）电泳缓冲液：Tris-硼酸EDTA（50TBE）pH8.0。 （8）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。 （9）溴化乙啶（EB）溶
12、液：10g/ml。 （10）琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。 (三)仪器 （1）稳压稳流电泳仪 （2）可调微量移液器 （3）水平电泳槽 （4）暗箱紫外透射仪等。,移液器的使用,使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。,三、实验步骤：,1取新鲜动物肝，称取2g，切成小块，加入4ml 0.14molL NaCl0.15molL EDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加4ml清洗转入离心管中，以4000rmin的转速离心 10min。,2在上述沉淀物中加入4mL 0.14molL NaCl0.15molL EDTA溶液，然后在60下，滴加 20SDS溶液35滴，边加边摇动，再摇动 10
13、min，使核酸与蛋白质分离。 3. 加固体氯化钠0.4g混匀，使其最终浓度达到l.4molL，水浴30min。,4加等体积的氯仿一异戊醇，混匀，摇动5min，以4000rmin的转速离心10min。离心管内的物质分为三层，上层为含DNA的水相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。,5吸出上清液，加入2倍体积95乙醇溶液（预冷），产生沉淀。 6.再以4000rmin的转速离心溶液10min，弃去上清液 (沉淀用80乙醇溶液离心洗涤)。 7将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入200ul 电极缓冲液，使DNA充分溶解，待用。,8.凝胶板的制备： （1）取琼脂糖0.7 g，
14、加1TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。 （2）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。 （3）插入梳子，梳齿下端离板底0.51mm。 （4）在胶床上滴加23滴 0.5g/mL的EB溶液。 （5）将60凝胶不间断倒入胶床，高34mm，避免气泡，摇匀，室温下凝固。 （6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面12mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。,9.加样： 将样品DNA溶液与加样缓冲液以5 ：1的体积比混合，用微量移液器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量1520 l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝
15、胶面以及穿透凝胶底部）。 10.电泳： 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。当染料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。 11. 观察 关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（红橙色荧光）。,五、思考题：,1、用荧光染料EB染色的原理和优缺点是什么？ 2、绘制DNA电泳图谱。,核酸提取过程中的注意事项：,（1）避免过酸过碱或高温环境，合适的T：04， pH4-9； （2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡； （3）防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂EDTA，柠檬酸钠； （4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。,