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1、高高 频频 考考 点点1.蛋蛋白白质质的提取和分离。的提取和分离。2.PCR技技术术的基本操作和的基本操作和应应用。用。实实 验验 要要 求求1.蛋蛋白白质质提取的原理和方法。提取的原理和方法。2.PCR技技术术的操作及原理。的操作及原理。第六章蛋白质和DNA技术 第一页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。1方法及原理方法及原理(1)方法：电泳法。方法：电泳法。(2)原理：原理：各种蛋白质分子带电性质的差异；各种蛋白质分子带电性质的差异；分子本身大小、形状的不同。分子本身大小、形状的不同。第二页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。2实验操作程序实验操作程序(1)点点样样：用用微微量量加加样样器
2、器取取新新制制血血清清，小小心心加加到到电电泳泳样样品品槽槽的胶面上。的胶面上。(2)电泳：打开并调节稳压稳流电泳仪进行电泳。电泳：打开并调节稳压稳流电泳仪进行电泳。(3)染染色色：用用质质量量分分数数为为0.05%的的考考马马斯斯亮亮蓝蓝R250染染色色液液对对凝凝胶进行染色。胶进行染色。(4)脱色：用体积分数为脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液脱色。的醋酸溶液脱色。(5)制制干干胶胶板板：保保存存液液浸浸泡泡凝凝胶胶板板后后，放放在在两两层层透透气气玻玻璃璃纸纸中间自然干燥。中间自然干燥。第三页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。特别提醒：特别提醒：相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分
3、子质量相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，而相对分子质量较大的蛋较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，而相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，移动速度快，因此蛋白质分子彼此分离。白质只能在凝胶外部移动，移动速度快，因此蛋白质分子彼此分离。第四页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。1.下面是凝胶色下面是凝胶色谱谱法分离血法分离血红红蛋白蛋白时样时样品的加入品的加入(图图)和洗脱和洗脱(图图)示意示意图图，请请据据图图回答下列回答下列问题问题。第五页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。(1)在加在加样样示意示意图图中，正确的加中，正确的加样顺样顺
4、序是序是_。(2)用吸管加用吸管加样时样时，应应注意正确操作，分注意正确操作，分别别是是_、_、_。(3)等等样样品品_时时，才加入，才加入缓缓冲液。冲液。(4)待待_接接近近色色谱谱柱柱底底端端时时，用用试试管管收收集集流流出出液液每每_mL收集一管，收集一管，连续连续收集。收集。第六页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。解析：解析：进行凝胶色谱操作加样时，加样前，打开色谱柱下端的流出进行凝胶色谱操作加样时，加样前，打开色谱柱下端的流出口，使核内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，用吸管小口，使核内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，用吸管小心地将心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱
5、的顶端，注意不可破坏凝胶透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不可破坏凝胶面。吸管应贴着管壁加样，待样品完全进入凝胶层后才可关闭下端面。吸管应贴着管壁加样，待样品完全进入凝胶层后才可关闭下端出口，加入缓冲液，待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集出口，加入缓冲液，待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每次流出液，每次5 mL收集一管，连续收集。收集一管，连续收集。答案：答案：(1)(2)不不要触及破坏凝胶面要触及破坏凝胶面贴贴着管壁加着管壁加样样使吸管管口沿管壁使吸管管口沿管壁环绕环绕移移动动(3)完全完全进进入凝胶入凝胶层层(4)红红色的色的蛋白蛋白质质5第七页，编辑于星期四：二十二
6、点 二十二分。1细胞内细胞内DNA复制与复制与PCR技术的比较技术的比较细胞内DNA复制PCR不同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制95高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶引物RNA人工合成的DNA单链温度体内温和条件高温相同点需提供DNA复制的模板；四种脱氧核糖核苷酸作原料；子链延伸的方向都是从5端到3端第八页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。2.PCR技术反应过程中控制不同温度的意义技术反应过程中控制不同温度的意义(1)95变变性，双性，双链链DNA解旋解旋为单链为单链；(2)55复性，引物与两条复性，引物与两条单链单链DNA结结合；合；(3)72延延伸伸
7、，耐耐高高温温的的DNA聚聚合合酶酶有有最最大大活活性性，使使DNA新新链链由由5端向端向3端延伸。端延伸。第九页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。2.多聚多聚酶酶链链式反式反应应（PCR）是一种体外迅速）是一种体外迅速扩扩增增DNA片段的技片段的技术术。PCR过过程一般程一般经历经历30多次下述循多次下述循环环：95条件下使模板条件下使模板DNA变变性、性、解解链链55条件下复性条件下复性(引物与引物与DNA模板模板链结链结合合)72条件下引条件下引物物链链延伸延伸(形成新的脱氧核苷酸形成新的脱氧核苷酸链链)。下列有关。下列有关PCR过过程的叙述，程的叙述，不正确的是不正确的是()第十页，
8、编辑于星期四：二十二点 二十二分。A变变性性过过程中破坏的是程中破坏的是DNA分子内碱基分子内碱基对对之之间间的的氢键氢键，也，也 可利用解旋可利用解旋酶酶实现实现B复性复性过过程中引物与程中引物与DNA模板模板链链的的结结合是依靠碱基互合是依靠碱基互补补配配对对 原原则则完成的完成的C延伸延伸过过程中需要程中需要DNA聚合聚合酶酶、ATP、4种核糖核苷酸种核糖核苷酸DPCR与与细细胞内胞内DNA复制相比，其所需要复制相比，其所需要酶酶的最适温度的最适温度较较 高高第十一页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。解解析析：PCR一一般般要要经经历历30多多次次循循环环，每每次次循循环环可可以以分分
9、为为变变性性、复复性性和和延延伸伸三三步步。从从第第二二轮轮循循环环开开始始，上上一一次次循循环环的的产产物物也也作作为为模模板板参参与与反反应应，并并且且由由引引物物延延伸伸而而成成的的DNA单单链链会会与与引引物物结结合合，进进行行DNA的的延延伸伸。DNA变变性性(9095)：双双链链DNA模模板板在在热热作作用用下下，氢氢键键断断裂裂，形形成成单单链链DNA。复复性性(5560)：系系统统温温度度降降低低，引引物物与与DNA模模板板结结合合，形形成成局局部部双双链链。延延伸伸(7075)：在在Taq酶酶(在在72左左右右活活性性最最高高)的的作作用用下下，以以dNTP(三三磷磷酸酸脱脱
10、氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸的的缩缩写写)为为原原料料，从从引引物物的的5端端向向3端延伸，合成与模板链互补的端延伸，合成与模板链互补的DNA链。链。答案：答案：C第十二页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。【例【例1】(2009广东高考广东高考)(1)商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生_，可根据其大小选择目的菌株，所得菌株需要进一步测定植酸，可根据其大小选择目的菌株
11、，所得菌株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间的单位时间的_表示。表示。第十三页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。(2)利用上述所得菌株制利用上述所得菌株制备备植酸植酸酶酶的流程如下的流程如下图图：中中的的主主要要成成分分为为_；中中包包含含植植酸酸酶酶等等多多种种蛋蛋白白质质。请请 写写 出出 一一 种种 纯纯 化化 得得 到到 植植 酸酸 酶酶 的的 方方 法法 及及 其其 依依 据据。_。第十四页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。(3)为为构构建建基基因因工工程程菌菌，可可用用PCR等等
12、技技术术从从上上述述菌菌株株中中克克隆隆植植酸酸酶酶基基 因因。PCR反反 应应 包包 括括 多多 次次 循循 环环。每每 次次 循循 环环 包包 括括 三三 步步：_。反反应应过过程程中中打打开开模模板板DNA双双链链的的方方法是法是_。(4)除除植植酸酸酶酶外外，微微生生物物还还能能应应用用在在哪哪些些酶酶的的生生产产中中？(至至少少写写两两种种)_第十五页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。错答案例：错答案例：（1）透透明圈明圈 植酸植酸钠钠的生成量的生成量（2）杂质杂质 电电游法游法 根据蛋根据蛋白白质质之之间间的的电电荷分子大小差异荷分子大小差异进进行行（3）变变异异恢复恢复延延长长
13、加加热热(4)纤维纤维素素酶酶 蛋白蛋白酶酶第十六页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。误误点点诊诊断断：本本题题综综合合考考查查酶酶的的应应用用及及PCR技技术术等等相相关关的的基基础础知知识识，题题目目背背景景较较新新，但但答答案案很很基基础础，由由于于学学生生答答题题不不够够仔仔细细，基基本本技技术术的的名名称称掌掌握握不不牢牢固固，基基本本技技术术的的流流程程把把握握不不准准确确导导致致出出错错，对对于于选选修修内内容容应应重重点点落落实实基基础础知知识识，规规范范用用语语，正正确确思思路为：路为：(1)当当植植酸酸钙钙被被植植酸酸酶酶分分解解以以后后，会会在在平平板板上上出出现现透透
14、明明圈圈。植植酸酸酶活性高低可以单位时间内底物减少量来表示。酶活性高低可以单位时间内底物减少量来表示。(2)透透析析的的目目的的是是将将酶酶与与发发酵酵液液分分开开。分分离离不不同同种种类类的的蛋蛋白白质质可可以用凝胶色谱法，原理是根据相对分子质量大小。以用凝胶色谱法，原理是根据相对分子质量大小。(3)PCR技技术术包包括括三三步步：变变性性复复性性延延伸伸，变变性性反反应应的的原原理理是是采用加热处理。采用加热处理。(4)微生物产生酶的种类很多。例如蛋白酶、脂肪酶等。微生物产生酶的种类很多。例如蛋白酶、脂肪酶等。第十七页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。正答示范：正答示范：(1)透透明圈植
15、酸明圈植酸钠钠的消耗量的消耗量(减少量减少量)或磷酸或磷酸(肌醇肌醇)的生的生成量成量(产产量量)(2)小分子小分子杂质杂质凝胶色凝胶色谱谱法：根据蛋白法：根据蛋白质质之之间间的分子的分子大小、吸附性大小、吸附性质质等差异等差异进进行行纯纯化化(或或电电泳法：根据蛋白泳法：根据蛋白质质之之间间的的电电荷、分子大小等差异荷、分子大小等差异进进行行纯纯化化)(3)变变性、复性和延伸性、复性和延伸(长长)加加热热(或高温或高温处处理理)(4)蛋白蛋白酶酶、脂肪、脂肪酶酶、纤维纤维素素酶酶第十八页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。【例【例2】近近十年来，十年来，PCR技技术术(多聚多聚酶酶链链式反式
16、反应应)成成为为分子生物学分子生物学实实验验室里的一种常室里的一种常规规手段，其原理是利用手段，其原理是利用DNA半保留复制，在半保留复制，在试试管中管中进进行行DNA的人工复制的人工复制(如如图图)，在很短的，在很短的时间时间内，将内，将DNA扩扩增几百万倍甚至几十增几百万倍甚至几十亿亿倍，使倍，使实验实验室所需要的室所需要的遗传遗传物物质质不再受不再受限于活的生物体。限于活的生物体。第十九页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。(1)加加热热使使DNA双双链链打打开开，这这一一步步是是打打开开_键键，称称为为_，细细胞中是在胞中是在_的作用下使此的作用下使此键键断裂的。断裂的。(2)当当温温
17、度度降降低低时时，引引物物与与模模板板_端端结结合合，在在DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，引引物物沿沿模模板板延延伸伸，最最终终合合成成两两个个DNA分分子子，此此过过程中原料是程中原料是_，遵循的原，遵循的原则则是是_。(3)PCR技技术术的的必必要要条条件件，除除了了模模板板、原原料料、ATP、酶酶以以外外，至至少少还还需需要要三三个个条条件件，即即：液液体体环环境境、适适宜宜的的_和和_。(4)如如图为图为某一次循某一次循环环的的产产物，物，请请据据图图回答回答问题问题。第二十页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。PCR一一般般要要经经历历三三十十多多次次循循环环，每每次次循循环环可
18、可分分为为_、_、_三个步三个步骤骤。DNA的的羟羟基基(OH)末末端端称称为为_，图图中中所所示示的的羟羟基基端端为为_(填字母填字母)。PCR技技术术与与细细胞胞内内DNA复复制制在在解解旋旋时时原原理理不不同同：细细胞胞内内复复制制利利用用_酶酶使使双双链链间间氢氢键键断断裂裂，而而PCR技技术术利利用用_原原理理使使双双链链间间氢氢键键断断裂裂。以以引引物物为为标标记记，可可判判断断出出此此产产物最早物最早为为第第_次循次循环环的的产产物。物。第二十一页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。思思路路点点拨拨：本本题题考考查查体体内内DNA复复制制与与PCR技技术术的的原原理理以以及及基基
19、本本条件。条件。(1)PCR技技术术利利用用热热变变性性原原理理使使DNA双双链链间间的的氢氢键键断断裂裂，称称为为解旋，而细胞中是在解旋酶的作用下使氢键断裂。解旋，而细胞中是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR技技术术扩扩增增DNA与与细细胞胞内内DNA复复制制所所需需原原料料一一样样，为为腺腺嘌嘌呤呤脱脱氧氧核核苷苷酸酸、鸟鸟嘌嘌呤呤脱脱氧氧核核苷苷酸酸、胞胞嘧嘧啶啶脱脱氧氧核核苷苷酸酸、胸胸腺腺嘧嘧啶啶脱脱氧氧核核苷苷酸酸，遵遵循循的的原原则则是是碱碱基基互互补补配配对对原原则则。引引物物与与模板的模板的3端结合后，端结合后，DNA聚合酶才发挥作用。聚合酶才发挥作用。第二十二页，编辑
20、于星期四：二十二点 二十二分。(3)PCR技技术术与与体体内内DNA复复制制不不完完全全相相同同，除除了了需需要要模模板板、原原料料、ATP、酶酶以以外外，至至少少还还需需要要液液体体环环境境(稳稳定定的的缓缓冲冲液液环环境境)、每一步骤需要适宜的温度及酸碱度。每一步骤需要适宜的温度及酸碱度。(4)PCR的的每每一一轮轮循循环环包包括括高高温温变变性性、低低温温复复性性和和中中温温延延伸伸三三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。第二十三页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。DNA的的两两条条链链是是反反向向平平行行的的
21、，为为了了明明确确地地表表示示DNA的的方方向向，通通常常将将DNA的的羟羟基基(OH)末末端端称称为为3端端，而而磷磷酸酸基基团团的的末末端端称称为为5端端。DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头合合成成DNA，只只能能从从3端端延延伸伸DNA链链。因因此此DNA复复制制需需要要引引物物，当当引引物物与与DNA母母链链通通过过碱碱基基互互补补配配对对结结合合后后，DNA聚聚合合酶酶就就能能从从引引物物的的3端端开开始始延延伸伸DNA链链，DNA的的合合成成方方向向总总是是从从子子链链的的5端端向向3端端延延伸伸。由由另另一一条条新新合合成的成的DNA可知，可知，A端为端为3端，端，B端为端为5端
22、，端，D端为端为3端。端。第二十四页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。DNA分分子子在在细细胞胞内内复复制制或或转转录录时时，在在解解旋旋酶酶的的作作用用下下使使氢氢键键断断裂裂，而而在在体体外外，DNA分分子子是是在在80100的的温温度度范范围围内内变变性性，即即双双螺螺旋旋解解开开，成成为为单单链链；当当温温度度慢慢慢慢降降低低后后，两两条条彼彼此分离的单链又会重新结合形成双链。此分离的单链又会重新结合形成双链。第二十五页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。在在PCR反反应应中中，以以引引物物为为标标记记，第第一一次次循循环环时时，以以加加入入的的DNA为为模模板板，两两条条DNA链链
23、可可分分别别由由引引物物和和引引物物与与其其结结合合并并在在DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下延延伸伸，所所以以形形成成的的每每个个子子DNA中中只只有有一一种种引引物物；从从第第二二次次循循环环开开始始，上上次次产产生生的的DNA分分子子又又可可作作为为模模板板参参与与反反应应，所所以以会会出出现现DNA分分子子两两端端均均含含引引物物的的情情况况，如如图图所示：所示：因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。第二十六页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。答案：答案：(1)氢氢解旋解旋解旋解旋酶酶(2)3四种脱氧核苷酸碱基互四种脱氧核苷酸碱基互补补配
24、配对对原原则则(3)温度酸碱度温度酸碱度(4)高温高温变变性低温复性中温延伸性低温复性中温延伸3端端A、D解旋解旋热变热变性一性一第二十七页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。【互动探究】【互动探究】(1)用用于于PCR的的引引物物一一般般长长度度为为2030个个核核苷苷酸酸，它它的的化化学学本本质质是什么？是什么？(2)PCR反反应应中中，如如果果以以引引物物为为标标记记，共共有有几几种种DNA分分子子产产生生？提提示示：(1)引引物物的的作作用用是是与与模模板板链链结结合合，提提供供3末末端端，使使DNA聚聚合合酶酶能能够够催催化化子子链链的的延延伸伸，在在生生物物体体内内DNA复复制制时时，引引物物一一般般为为一一小小段段RNA，但但在在PCR反反应应中中，可可以以是是一一小小段段DNA或或RNA。(2)共有共有3种。种。第二十八页，编辑于星期四：二十二点 二十二分。