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1、高考生物大一轮复习 蛋白质和DNA技术课件 中图版选修本讲稿第一页，共三十三页第六章蛋白质和DNA技术本讲稿第二页，共三十三页【考考纲纲考情考情】最新考纲及要求三年考情(以山东高考卷为例)2014年2013年2012年蛋白质的提取和分离无无无PCR技术的基本操作和应用T35非选择题无无本讲稿第三页，共三十三页【知识梳理知识梳理】考点一考点一 血清蛋白的提取和分离血清蛋白的提取和分离1.1.方法及原理：方法及原理：(1)(1)方法：电泳法。方法：电泳法。(2)(2)原理：原理：各种蛋白质分子带电性质的差异；各种蛋白质分子带电性质的差异；分子本身大小、形状的不同。分子本身大小、形状的不同。本讲稿第
2、四页，共三十三页2.2.实验实验操作程序：操作程序：(1)(1)点点样样：用微量加：用微量加样样器取新制血清，小心加到器取新制血清，小心加到电电泳泳样样品槽的胶面上。品槽的胶面上。(2)(2)电电泳：打开并泳：打开并调节稳压稳调节稳压稳流流电电泳泳仪进仪进行行电电泳。泳。(3)(3)染色：用染色：用质质量分数量分数为为0.05%0.05%的考的考马马斯亮斯亮蓝蓝R R250250染色液染色液对对凝胶凝胶进进行染色。行染色。(4)(4)脱色：用体脱色：用体积积分数分数为为7%7%的醋酸溶液脱色。的醋酸溶液脱色。(5)(5)制干胶板：保存液浸泡凝胶板后，放在两制干胶板：保存液浸泡凝胶板后，放在两层
3、层透气玻璃透气玻璃纸纸中中间间自然干燥。自然干燥。本讲稿第五页，共三十三页【高考警示高考警示】(1)(1)电泳时，带电的颗粒向与其电性相反的电极方向移动。电泳时，带电的颗粒向与其电性相反的电极方向移动。(2)(2)电泳时，蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分电泳时，蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，则移动越快。子量越小，则移动越快。本讲稿第六页，共三十三页考点二考点二 DNADNA片段的扩增片段的扩增1.1.细胞内细胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术的比较：技术的比较：项目DNA复制PCR扩增不同点场所细胞内细胞外能量ATP提供能量不需AT
4、P提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的TaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录，产生引物无转录，需加入两种引物特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30多次缓冲液不需要需要人为控制设备无严格控制温度变化的温控设备本讲稿第七页，共三十三页项目DNA复制PCR扩增相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNA为模板引物都需要与模板相结合的引物本讲稿第八页，共三十三页2.PCR2.PCR技术反应过程中控制不同温度的意义：技术反应过程中控制不同温度的意义：(1)95(1)95变性，双链变性，双链DNADNA解旋为单链。解旋为单链。(2)55(2)55复性，引
5、物与两条单链复性，引物与两条单链DNADNA结合。结合。(3)72(3)72延伸，耐高温的延伸，耐高温的DNADNA聚合酶有最大活性，使聚合酶有最大活性，使DNADNA新链由新链由55端向端向33端端延伸。延伸。本讲稿第九页，共三十三页【高考警示高考警示】PCRPCR技技术术的一个循的一个循环环包括高温包括高温变变性、低温复性和中温延伸三个步性、低温复性和中温延伸三个步骤骤；每一；每一循循环环中中DNADNA聚合聚合酶酶只能特异地复制只能特异地复制处处于两个引物之于两个引物之间间的的DNADNA序列，使序列，使这这段固定段固定长长度的序列呈指数增度的序列呈指数增长长。本讲稿第十页，共三十三页类
6、类型一型一 蛋白蛋白质质的提取和分离的提取和分离【典例典例1 1】(2015(2015济济南模南模拟拟)血血红红蛋白是人和其他脊椎蛋白是人和其他脊椎动动物物红细红细胞的主要胞的主要组组成成成成分，分，负责负责血液中血液中O O2 2和部分和部分COCO2 2的运的运输输。请请根据血根据血红红蛋白的提取和分离回答蛋白的提取和分离回答问题问题：(1)(1)凝胶色凝胶色谱谱法的基本原理是根据法的基本原理是根据_分离蛋白分离蛋白质质的有效方法。的有效方法。本讲稿第十一页，共三十三页(2)(2)洗涤红细胞的目的是去除洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法除去，洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高
7、和时间过长会使；离心速度过高和时间过长会使_等一同沉等一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。(3)(3)洗脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体洗脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_(_(填填“相同相同”或或“不同不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是，洗脱时，对洗脱液的流速要求是_。本讲稿第十二页，共三十三页(4)(4)在洗脱在洗脱过过程中加入物程中加入物质质的量的量浓浓度度为为20 mmol/L20 mmol/L的磷酸的磷酸缓缓冲液冲液(pH(pH为为7.0)7.0)的目的是的目的
8、是_，如果，如果红红色区色区带带_，说说明色明色谱谱柱制作成功。柱制作成功。【解题指南解题指南】(1)(1)关键词：关键词：“洗涤红细胞洗涤红细胞”“”“离心速度离心速度”“”“释放血红蛋白释放血红蛋白”。(2)(2)隐含信息：红色区带为血红蛋白。隐含信息：红色区带为血红蛋白。本讲稿第十三页，共三十三页【解析解析】(1)(1)凝胶色谱法是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。凝胶色谱法是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。(2)(2)洗涤红细胞的目的是去除血浆蛋白等杂蛋白，如果洗涤次数过少，无法除去血洗涤红细胞的目的是去除血浆蛋白等杂蛋白，如果洗涤次数过少，无法除去血
9、浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。洗浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是离心后的上清液中没有黄色。释放血红蛋白的过程中起作用的是蒸涤干净的标志是离心后的上清液中没有黄色。释放血红蛋白的过程中起作用的是蒸馏水和甲苯，其中蒸馏水的作用是使红细胞吸水破裂，甲苯可溶解细胞膜，加入甲馏水和甲苯，其中蒸馏水的作用是使红细胞吸水破裂，甲苯可溶解细胞膜，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放血红蛋白。苯能加速红细胞破裂并释放血红蛋白。本讲稿第十四页，共三十三页(3)(3)洗脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体相同，否则会影响洗脱液的洗
10、脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体相同，否则会影响洗脱液的pHpH，使蛋白质的结构受到破坏。洗脱时，洗脱液的流速要保持稳定，否则将影使蛋白质的结构受到破坏。洗脱时，洗脱液的流速要保持稳定，否则将影响蛋白质的分离效果。响蛋白质的分离效果。(4)(4)在洗脱过程中加入物质的量浓度为在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L20 mmol/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH(pH为为7.0)7.0)的目的的目的是准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的是准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pHpH和体内的一致，进而保和体内的一致，进而保持蛋白质的正常形态结构；洗脱时，血红蛋白的颜色可以指示血红蛋
11、白持蛋白质的正常形态结构；洗脱时，血红蛋白的颜色可以指示血红蛋白的位置，因此当红色区带均匀一致地移动时，说明色谱柱制作成功。的位置，因此当红色区带均匀一致地移动时，说明色谱柱制作成功。本讲稿第十五页，共三十三页答案：答案：(1)(1)相对分子质量的大小相对分子质量的大小(2)(2)杂蛋白杂蛋白(血浆蛋白血浆蛋白)血浆蛋白白细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏血浆蛋白白细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯水和甲苯(3)(3)相同保持稳定相同保持稳定(4)(4)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pHpH和体内的一致均匀一致和体内的一致均匀一致地移动地移动本
12、讲稿第十六页，共三十三页【延伸探究延伸探究】在血在血红红蛋白的提取蛋白的提取过过程中，哪些程中，哪些过过程能影响血程能影响血红红蛋白提取的蛋白提取的纯纯度？度？提示：提示：细胞的洗涤次数：次数少，不能除去血浆蛋白。细胞的洗涤次数：次数少，不能除去血浆蛋白。离心速度和时间：离心速度过高和时间过长，会使白细胞等一同沉淀，离心速度和时间：离心速度过高和时间过长，会使白细胞等一同沉淀，得不到纯净的红细胞。得不到纯净的红细胞。透析：透析不彻底，会含有小分子杂质。透析：透析不彻底，会含有小分子杂质。色谱柱的装填：不能存在气泡，若存在气泡，则会降低分离效果。色谱柱的装填：不能存在气泡，若存在气泡，则会降低分
13、离效果。洗脱：洗脱液的流速要保持稳定，否则将影响蛋白质的分离效果。洗脱：洗脱液的流速要保持稳定，否则将影响蛋白质的分离效果。本讲稿第十七页，共三十三页【加固加固训练训练】红细红细胞含有大量血胞含有大量血红红蛋白，蛋白，红细红细胞的机能主要是由血胞的机能主要是由血红红蛋白完成的，血蛋白完成的，血红红蛋白的主要功能是携蛋白的主要功能是携带带O O2 2或或COCO2 2，我，我们们可以可以选选用用猪、牛、羊或其他脊椎猪、牛、羊或其他脊椎动动物的血液物的血液进进行行实验实验，来提取和分离血，来提取和分离血红红蛋蛋白，白，请请回答下列有关回答下列有关问题问题：(1)(1)实验实验前取新前取新鲜鲜的血液
14、，要切的血液，要切记记在采血容器中在采血容器中预预先加入先加入柠柠檬酸檬酸钠钠，取血回来，取血回来，马马上上进进行离心，收集血行离心，收集血红红蛋白溶液。蛋白溶液。加入加入柠柠檬酸檬酸钠钠的目的是的目的是_。以上所述的以上所述的过过程即是程即是样样品品处处理，它包括理，它包括_、_、收集血、收集血红红蛋白溶液。蛋白溶液。本讲稿第十八页，共三十三页(2)(2)收集的血收集的血红红蛋白溶液在透析袋中可以蛋白溶液在透析袋中可以经过经过透析，透析，这这就是就是样样品的品的粗分离。粗分离。透析的目的是透析的目的是_。透析的原理是透析的原理是_。【解析解析】本题主要考查蛋白质分离与鉴定的基本原理及实验流程
15、。本题主要考查蛋白质分离与鉴定的基本原理及实验流程。柠檬酸钠属于抗凝剂，血红蛋白是红色含铁的蛋白质。柠檬酸钠属于抗凝剂，血红蛋白是红色含铁的蛋白质。本讲稿第十九页，共三十三页答案：答案：(1)(1)防止血液凝固防止血液凝固红细胞的洗涤血红蛋白的释放红细胞的洗涤血红蛋白的释放(2)(2)去除相对分子质量较小的杂质去除相对分子质量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内本讲稿第二十页，共三十三页类类型二型二 PCRPCR扩扩增增DNADNA技技术术【典例典例2 2】(2011(2011江江苏苏高考高考)请请回答基因工程方面的有关回答基因
16、工程方面的有关问题问题：(1)(1)利用利用PCRPCR技技术扩术扩增目的基因，其原理与增目的基因，其原理与细细胞内胞内DNADNA复制复制类类似似(如如图图所示所示)。本讲稿第二十一页，共三十三页图图中引物中引物为单链为单链DNADNA片段，它是子片段，它是子链链合成延伸的基合成延伸的基础础。从理从理论论上推上推测测，第四，第四轮轮循循环产环产物中含有引物物中含有引物A A的的DNADNA片段所占的比片段所占的比例例为为_。在第在第_轮轮循循环产环产物中开始出物中开始出现现两条脱氧核苷酸两条脱氧核苷酸链链等等长长的的DNADNA片段。片段。本讲稿第二十二页，共三十三页(2)(2)设计设计引物
17、是引物是PCRPCR技技术术关关键键步步骤骤之一。某同学之一。某同学设计设计的两的两组组引物引物(只只标标注了部分碱注了部分碱基序列基序列)都不合理都不合理(如如图图)，请请分分别说别说明理由。明理由。第第1 1组组：_；第第2 2组组：_。本讲稿第二十三页，共三十三页(3)PCR(3)PCR反反应应体系中含有体系中含有热稳热稳定定DNADNA聚合聚合酶酶，下面的表达式不能正确反，下面的表达式不能正确反映映DNADNA聚合聚合酶酶的功能，的功能，这这是因是因为为_。本讲稿第二十四页，共三十三页(4)(4)用限制用限制酶酶EcoRVEcoRV、MboMbo单单独或独或联联合切割同一种合切割同一种
18、质质粒，得到的粒，得到的DNADNA片段片段长长度度如下如下图图(1 kb(1 kb即即1 0001 000个碱基个碱基对对)，请请在在质质粒上画出粒上画出EcoRVEcoRV、MboMbo的切割位点。的切割位点。本讲稿第二十五页，共三十三页【解题指南解题指南】解答本题应特别关注以下两个方面：解答本题应特别关注以下两个方面：(1)(1)明确明确PCRPCR技术中引物的设计原则。技术中引物的设计原则。(2)(2)明确不同限制性内切酶的切割位点不同。明确不同限制性内切酶的切割位点不同。【解析解析】(1)(1)从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A A的的DN
19、ADNA片段所占的比片段所占的比例为例为15/1615/16。在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNADNA片段。片段。(2)(2)某同学设计的两组引物某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列只标注了部分碱基序列)都不合理，原因都不合理，原因引物引物和引物和引物局部发生碱基互补配对而失效。局部发生碱基互补配对而失效。引物引物自身折叠后会出现局部碱自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。基互补配对而失效。(3)DNA(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNADNA片片段的引物链
20、上。段的引物链上。本讲稿第二十六页，共三十三页答案：答案：(1)15/16(1)15/16三三(2)(2)引物引物和引物和引物局部发生碱基互补配对而失效局部发生碱基互补配对而失效引物引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNADNA片段的引物链上片段的引物链上(4)(4)见图见图本讲稿第二十七页，共三十三页【延伸探究延伸探究】(1)(1)上上题题(1)(1)中中变变性、复性、延伸需要的温度分性、复性、延伸需要的温度分别别是多少？是多少？提示：提示：9
21、595、5555、7272。当温度上升到。当温度上升到9090以上时，双链以上时，双链DNADNA解聚为单链，解聚为单链，称之为变性；当温度下降到称之为变性；当温度下降到5050左右时，两种引物通过碱基互补配对与两左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链条单链DNADNA结合；当温度上升到结合；当温度上升到7272左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNADNA链，称为延伸。链，称为延伸。本讲稿第二十八页，共三十三页(2)PCR(2)PCR一般要一般要经
22、过经过三十多次循三十多次循环环，从第二，从第二轮轮循循环环开始，上一次循开始，上一次循环环的的产产物也作物也作为为模模板参与反板参与反应应，由引物，由引物A A延伸而成的延伸而成的DNADNA单链单链作作为为模板模板时时将如何延伸？将如何延伸？提示：提示：与引物与引物B B结合进行结合进行DNADNA子链的延伸。当引物子链的延伸。当引物A A延伸而成的单链作模板时，延伸而成的单链作模板时，此单链引物端为此单链引物端为55端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物B B结合延伸的子链。结合延伸的子链。本讲稿第二十九页，共三十三页【加固加固
23、训练训练】PCR(PCR(聚合聚合酶酶链链式反式反应应)技技术术是一是一项项在生物体外复制特定的在生物体外复制特定的DNADNA片段的核酸合成技片段的核酸合成技术术。请请分析回答下列有关分析回答下列有关问题问题：本讲稿第三十页，共三十三页(1)PCR(1)PCR技技术术能把某一能把某一DNADNA片段片段进进行行扩扩增，依据的原理是增，依据的原理是_。(2)(2)通通过过分析得出新合成的分析得出新合成的DNADNA分子中，分子中，A=TA=T，C=GC=G，这这个事个事实说实说明明DNADNA分子的复制遵循分子的复制遵循_原原则则。(3)(3)若将若将1 1个个DNADNA分子拷分子拷贝贝10
24、10次，次，则则需要在需要在缓缓冲液中至少加入冲液中至少加入_个引物。个引物。(4)DNA(4)DNA子子链链复制的方向是复制的方向是_，这这是由于是由于_。本讲稿第三十一页，共三十三页【解析解析】(1)PCR(1)PCR技术又称聚合酶链式反应，扩增过程中遵循的原理就是技术又称聚合酶链式反应，扩增过程中遵循的原理就是DNADNA复制。复制。(2)(2)分析得出新合成的分析得出新合成的DNADNA分子中，分子中，A=TA=T，C=GC=G，这个事实说明，这个事实说明DNADNA分子的合成遵分子的合成遵循碱基互补配对原则。循碱基互补配对原则。(3)(3)在在DNADNA分子扩增时，需要两种引物，由
25、于新合成的子链都需要引物作为复制的分子扩增时，需要两种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需引物数目等于新合成的起点，故所需引物数目等于新合成的DNADNA子链数目，即子链数目，即22221010-2=2-2=21111-2-2个。个。本讲稿第三十二页，共三十三页(4)(4)引物是一种单链引物是一种单链DNADNA或或RNARNA分子，它能与解开的分子，它能与解开的DNADNA母链的母链的33端结合，为端结合，为DNADNA聚合酶提供吸附位点，使聚合酶提供吸附位点，使DNADNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸分子，从而决定了分子，从而决定了DNADNA子链复制的方向是从子链复制的方向是从55端到端到33端。端。答案：答案：(1)DNA(1)DNA复制复制(2)(2)碱基互补配对碱基互补配对(3)2(3)21111-2-2(4)(4)从从55端到端到33端端DNADNA聚合酶只能从引物的聚合酶只能从引物的33端连接单个脱氧核苷酸分端连接单个脱氧核苷酸分子子本讲稿第三十三页，共三十三页