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1、v 现代生物技术的概念现代生物技术的概念现代生物技术的概念现代生物技术的概念v 技术手段（种类）技术手段（种类）技术手段（种类）技术手段（种类）第一章第一章 绪绪 论论1第二章第二章 基因工程基因工程（Gene EngineeringGene Engineering）2基因工程的一般流程目的基因的获取载体的构建体外重组导入宿主细胞筛选及鉴定重组子3基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶1.限制性内切酶限制性内切酶2.连接酶连接酶3.末端修饰酶末端修饰酶 4基因克隆载体的概念：基因克隆载体的概念：作为基因克隆载体一般应具备的条件：作为基因克隆载体一般应具备的条件：作为基因克隆载体一般应具备
2、的条件：作为基因克隆载体一般应具备的条件：（1 1）多克隆位点）多克隆位点）多克隆位点）多克隆位点 （2 2）自我复制；或能整合到染色体）自我复制；或能整合到染色体）自我复制；或能整合到染色体）自我复制；或能整合到染色体DNADNA、线粒体、线粒体、线粒体、线粒体DNADNA和叶绿和叶绿和叶绿和叶绿体体体体DNADNA中，随这些中，随这些中，随这些中，随这些DNADNA同步复制。同步复制。同步复制。同步复制。（3 3）选择标记基因）选择标记基因）选择标记基因）选择标记基因 （4 4）克隆载体必须是安全的）克隆载体必须是安全的）克隆载体必须是安全的）克隆载体必须是安全的 （5 5）载体）载体）载
3、体）载体DNADNA分子应尽可能小，插入片段的范围有选择性分子应尽可能小，插入片段的范围有选择性分子应尽可能小，插入片段的范围有选择性分子应尽可能小，插入片段的范围有选择性基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体5载体类型载体类型严紧型质粒和松弛型质粒严紧型质粒和松弛型质粒lacZlacZlacZlacZ蓝蓝-白斑筛选白斑筛选（1）穿梭质粒载体（）穿梭质粒载体（shuttle vector）：）：（2 2）T T克隆载体和克隆载体和克隆载体和克隆载体和U U克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体（3 3）TiTi质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体（4 4）柯斯质粒载体）柯斯质粒载体（5 5）YAC B
4、ACYAC BAC6目的基因片段的获取目的基因片段的获取1 目的基因的来源目的基因的来源2 获得目的基因的途径获得目的基因的途径2.1 限制性酶切法；限制性酶切法；2.2 PCR法；法；2.3 化学合成法；化学合成法；2.4 基因组文库或基因组文库或cDNA文库法；文库法；7模板模板模板模板DNADNADNADNA的变性：的变性：的变性：的变性：95959595模板模板模板模板DNADNADNADNA与引物的退火与引物的退火与引物的退火与引物的退火(复性复性复性复性)：60 60 60 60 引物的延伸：引物的延伸：引物的延伸：引物的延伸：72 72 72 72 重复循环变性重复循环变性-退火
5、退火-延伸三过程，就可获得更多的延伸三过程，就可获得更多的“半保留半保留复制链复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需个循环需24分钟，分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。几百万倍。电泳电泳PCRPCRPCRPCR基本过程（反应步骤）：基本过程（反应步骤）：基本过程（反应步骤）：基本过程（反应步骤）：8 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞方法：方法：方法：方法：转化转化：通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露：通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并整合
6、到受体染色体组，在受体进入受体细胞，并整合到受体染色体组，在受体内稳定维持和表达的过程。内稳定维持和表达的过程。转染：转染：如果进入受体细胞的外源如果进入受体细胞的外源DNA分子是病毒（噬分子是病毒（噬菌体）的菌体）的DNA,则把此过程称为则把此过程称为转染转染。转导转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被导入被感染的受体细胞的过程。感染的受体细胞的过程。9 重组子重组子的筛选的筛选筛选方法：筛选方法：筛选方法：筛选方法：（一）（一）（一）（一）根据载体选择标记基因筛选根据载体选择标记基因筛选根据载体选择标记基因筛选根据载体选择标记基因筛选抗性筛选、蓝白斑
7、筛选抗性筛选、蓝白斑筛选 gus gus gus gus 基因基因基因基因、荧光素酶基因荧光素酶基因lucluc、绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因gfpgfp，（二）（二）（二）（二）根据报告基因筛选转化子根据报告基因筛选转化子根据报告基因筛选转化子根据报告基因筛选转化子（三）（三）（三）（三）根据形成噬菌斑筛选转化子根据形成噬菌斑筛选转化子根据形成噬菌斑筛选转化子根据形成噬菌斑筛选转化子101 1 根据重组根据重组DNADNA分子特征鉴定重组子分子特征鉴定重组子 根据重组根据重组DNADNA分子大小鉴定重组子、根据重组分子大小鉴定重组子、根据重组DNADNA分子酶切图分子酶切图谱鉴定、谱鉴定
8、、PCRPCR法、法、DNADNA杂交、应用杂交、应用DNADNA芯片鉴定重组子、根据芯片鉴定重组子、根据DNADNA核苷酸序列鉴定重组子核苷酸序列鉴定重组子重组子重组子的鉴定的鉴定2 2 根据目的基因转录产物（根据目的基因转录产物（mRNAmRNA）鉴定重组子）鉴定重组子 NorthernNorthern杂交杂交 RT-PCR RT-PCR：3 根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）鉴定根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）鉴定重组子重组子Western11基因工程的一般步骤基因工程的一般步骤(目的基因未知）目的基因未知）生物材料生物材料生物材料生物材料RNARNARNARNADNADN
9、ADNADNAmRNAmRNAmRNAmRNAcDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库人工合成人工合成人工合成人工合成目的基因目的基因目的基因目的基因克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体重组重组重组重组DNADNADNADNA受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞克隆子克隆子克隆子克隆子转基因生物转基因生物转基因生物转基因生物12第三章第三章 细胞工程细胞工程 第一节第一节 细胞工程基本知识与基本技术细胞工程基本知识与基本技术 第二节第二节 植物细胞工程植物细胞工程 第三节第三节 动物细胞工程动物细胞工程 第四节第四节 微生物细胞工程微生物细胞工程13第二
10、节第二节 植物细胞工程植物细胞工程1.植物组织培养的基本过程：植物组织培养的基本过程：预备阶段：预备阶段：诱导去分化阶段：诱导去分化阶段：继代增殖阶段：继代增殖阶段：生根发芽阶段：生根发芽阶段：移栽成活阶段移栽成活阶段:2.1 植物组织培养植物组织培养14化学或物化学或物理法诱导理法诱导完全杂合、核质异源完全杂合、核质异源杂合体的鉴别与筛选杂合体的鉴别与筛选酶解（纤维素酶）、酶解（纤维素酶）、分离、洗涤、鉴定分离、洗涤、鉴定取材与除菌取材与除菌2.2 植物细胞原生质体制备与融合植物细胞原生质体制备与融合152.3 2.3 人工种子人工种子用人工种皮包被植物胚状体或芽、营养成分、用人工种皮包被植
11、物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。激素以及其他成分的人工胶囊。16人工种子人工种子解决有些植物解决有些植物结子困难、发结子困难、发芽率低、繁殖芽率低、繁殖困难等问题困难等问题17制作过程制作过程胚乳与褐藻胚乳与褐藻酸钠混合后，酸钠混合后，加入胚状体，加入胚状体，滴入到硝酸滴入到硝酸钙或钙或CaClCaCl2 2中，中，2 2分钟后，分钟后，表面聚合，表面聚合，形成人工种形成人工种子子181.动物细胞、组织培养技术动物细胞、组织培养技术生长特点：贴壁生长，接触抑制生长特点：贴壁生长，接触抑制细胞株细胞株 细胞系细胞系第三节第三节 动物细胞工程动物细胞工程19 2.动物细胞融合技
12、术动物细胞融合技术动物细胞融合的途径：动物细胞融合的途径：病毒诱导、化学诱导、电激诱导病毒诱导、化学诱导、电激诱导淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术：淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术：淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术：淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术：单克隆抗体单克隆抗体 单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程 3.动物克隆动物克隆技术技术20合成抗体体外增值213.微生物细胞工程微生物细胞工程细胞融合技术概括起来主要包括细胞融合技术概括起来主要包括制备原生质体，制备原生质体，诱导细胞融合，筛选杂合细胞诱导细胞融合，筛选杂合细胞 22第四章第四章 发酵工程发酵工程23一、发酵工程概况：一、发酵
13、工程概况：现代发酵工程的定义现代发酵工程的定义;发酵周期；放罐时间发酵周期；放罐时间二、发酵过程：二、发酵过程：发酵类型：菌体；酶；代谢产物；转化；生物工程菌发酵类型：菌体；酶；代谢产物；转化；生物工程菌第四章第四章 发酵工程发酵工程培养基原料 培养基配制 培养基灭菌 菌体储备菌种 摇瓶 种子罐 生产罐 培养 细胞分离 无细胞上清液 产品抽提 产品精制 产品包装24三、液体深层发酵：三、液体深层发酵：液体深层发酵的操作方式（分批发酵；连续发酵；补料分液体深层发酵的操作方式（分批发酵；连续发酵；补料分批发酵）；各自优缺点；发酵过程主要影响参数批发酵）；各自优缺点；发酵过程主要影响参数四、发酵设备
14、四、发酵设备(发酵罐）：发酵罐）：25第五章第五章 酶工程酶工程酶反应器酶反应器发酵生产的优点、菌发酵生产的优点、菌种筛选、发酵方式、种筛选、发酵方式、提高酶产量的措施提高酶产量的措施酶的制备技术酶的制备技术酶的纯化与精制酶的纯化与精制固定化酶固定化酶(细胞细胞)的优点、固定的优点、固定化方法化方法酶分子的改酶分子的改造技术造技术酶反应器基本酶反应器基本类型、生物传类型、生物传感器感器酶工程的概念和基本过程（酶的分类）酶工程的概念和基本过程（酶的分类）26第一节第一节第一节第一节 酶的发酵生产酶的发酵生产酶的发酵生产酶的发酵生产提高酶产量的措施提高酶产量的措施 诱导物诱导物 阻遏物阻遏物 表面
15、活性剂表面活性剂 产酶促进剂产酶促进剂27第二节第二节第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化酶的分离纯化酶的分离纯化酶的制备技术酶的制备技术(破碎细胞、溶剂抽提、离心分离、过滤破碎细胞、溶剂抽提、离心分离、过滤、浓缩、浓缩、干燥干燥);纯化与精制的方法（酶分子大小、电荷性质、专一性结合特性）纯化与精制的方法（酶分子大小、电荷性质、专一性结合特性）；第三节第三节第三节第三节 酶分子的改造酶分子的改造酶分子的改造酶分子的改造酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法28第四节第四节第四节第四节 酶的固定化技术酶的固定化技术酶的固定化技术酶的固定化技术固定化酶（细胞）的优点（不溶于水，便于分离；能回收、反固定
16、化酶（细胞）的优点（不溶于水，便于分离；能回收、反复使用；稳定性；生产自动化；但不会持续维持生产能力逐渐复使用；稳定性；生产自动化；但不会持续维持生产能力逐渐提高）提高）酶固定化方法（载体结合、共价交联、包埋）酶固定化方法（载体结合、共价交联、包埋）细胞固定化方法（直接法，包埋法，物理吸附法）细胞固定化方法（直接法，包埋法，物理吸附法）29酶生物合成的模式酶生物合成的模式通过分析比较细胞生长与酶产生的关系通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生可以把酶生物合成的模式分同步合成型，延续合成型，中期合成物合成的模式分同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。型和滞后合成型。30v蛋白质
17、工程概念，表达体系、设计目标蛋白质工程概念，表达体系、设计目标v 蛋白质工程研究的技术和方法：蛋白质工程研究的技术和方法：蛋白质结晶学（蛋白质结晶学（蛋白质结晶学（蛋白质结晶学（X X X X光衍射技术、核磁共振光衍射技术、核磁共振光衍射技术、核磁共振光衍射技术、核磁共振NMRNMR ）；）；）；）；蛋白质动力学（生物信息学、计算机辅助设计）；蛋白质动力学（生物信息学、计算机辅助设计）；蛋白质动力学（生物信息学、计算机辅助设计）；蛋白质动力学（生物信息学、计算机辅助设计）；改变蛋白质结构的核心技术是人工定点突变技术改变蛋白质结构的核心技术是人工定点突变技术改变蛋白质结构的核心技术是人工定点突变
18、技术改变蛋白质结构的核心技术是人工定点突变技术（位点特异性突变技术）（位点特异性突变技术）（位点特异性突变技术）（位点特异性突变技术）第六章第六章 蛋白质工程蛋白质工程31目前蛋白质工程研究的主要领域，研究程序一般如下：目前蛋白质工程研究的主要领域，研究程序一般如下：（1 1）分离纯化得到）分离纯化得到0.10.11.0mg1.0mg纯目的蛋白质纯目的蛋白质（2 2）测定其部分肽段的一级结构，根据编码原则合成）测定其部分肽段的一级结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针相应同位素标记的寡苷酸探针 （3 3）利用该探针从基因库中分离编码该蛋白质的克隆）利用该探针从基因库中分离编码该蛋白质
19、的克隆化基因化基因32（4 4）通过表达载体获得较大量）通过表达载体获得较大量(0.1(0.11.01.0克克)该蛋白该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案提出分子预测性质及改造方案（5 5）基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达）基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子 33蛋白质组学（蛋白质组学（Proteomics）“Prote
20、ome”最终概念是指：一个基因组，一种生最终概念是指：一个基因组，一种生物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。蛋白质组学（蛋白质组学（Proteomics)：以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的一门科学领域。功能蛋白质组（功能蛋白质组（Functional Proteome)：指在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。功能蛋白质组学（功能蛋白质组学（Functional Proteomics）：）：研究细胞内与某种功能有关或在某种条件下的一群蛋白质。34双向电泳技术第一向等电聚焦（IEF）电泳：利用蛋白质具有不同等电
21、点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质的电泳方法。用缓冲液水化 第二向SDS-PAGE：SDS，巯基乙醇，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，样品中的蛋白质成分按照蛋白质分子量的大小加以分离。通过染色，进行蛋白质计算机软件分析。35第七章第七章 生物技术的应用领域生物技术的应用领域7.1 生物技术与人类健康（人生长激素释放抑制剂激生物技术与人类健康（人生长激素释放抑制剂激素、基因治疗）素、基因治疗）7.2 生物技术与环境生物技术与环境（生物修复）（生物修复）7.3生物技术与能源生物技术与能源生物技术在上述各领域的应用或对人类社会的影响生物技术在上述各领域的应用或对人类社会的影响36谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH